论文题目: 梨离体再生和遗传转化的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 果树学
作者: 徐凌飞
导师: 李嘉瑞
关键词: 离体再生,农杆菌介导,遗传转化
文献来源: 西北农林科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究以砀山酥梨（P.bretschnrideri Rehd.）、八月红梨（P.communis L.X P.bretschnrideri Rehd.）等多个栽培品种为试验材料,通过对影响叶片、叶柄和节间茎段离体再生不定芽以及根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化的若干因素的研究,建立起不同外植体水平的梨再生体系以及遗传转化体系。利用几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶双价基因进行了遗传转化,分子生物学分析证明,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶双价基因已经整合到转化植株基因组中,获得了八月红梨和砀山酥梨2个品种的转基因植株。 主要研究结果如下: 1.试验从砀山酥、八月红等5个梨品种叶片诱导出不定芽,其中砀山酥、八月红、早酥梨等品种叶片再生不定芽为首次获得,建立起八月红、水晶和砀山酥梨等品种叶片高效再生体系。 试验系统地研究了影响梨叶片再生不定芽的多种因子的效应,建立起叶片高效再生体系。在最佳条件下,八月红、水晶和砀山酥梨的再生频率分别100%、77.8%和83.3%,平均再生芽数分别为5.78、3.17和1.58。 不同品种叶片再生效率不同,基因型是影响叶片再生能力的关键因子,八月红梨叶片再生能力高于其它品种。基本培养基类型对叶片再生有重要影响,NN69培养基适宜于梨叶片再生。采用试管苗顶部幼嫩叶片为外植体,叶片接种时叶片远轴面向下接触培养基,培养基附加40g·L-1蔗糖,培养基pH值为5.6,接种后暗培养20d等可显著地提高叶片再生频率。植物激素种类组成和浓度配比是影响梨叶片离体再生的最关键因子之一,不同梨品种叶片高频率再生需要不同的激素种类组合和浓度配比。TDZ适宜八月红和水晶梨叶片再生,6-BA适宜砀山酥梨和红茄梨叶片再生,ZT和KT不适宜梨叶片再生。生长素种类对梨叶片再生不定芽有显著影响。IBA适宜于八月红梨叶片再生,IAA适宜于水晶梨叶片再生。培养基附加0.5mg·L-1AgNO3 可显著地提高八月红梨叶片再生频率。 基木培养基类型和6-BA浓度是影响砀山酥梨叶片再生芽增殖的主要因素,适宜的增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1。 利用正交试验设计研究了基本培养基、吲哚丁酸、茶乙酸、蔗糖、暗培养时间等5个因素对砀山酥、八月红梨叶片再生苗生根的影响。结果表明,砀同酥梨叶片再生苗生根的适宜组合为1/4MS+0.5 mg·L-1 IBA+ sucrose 20 g·L-1,暗培养5d。八月红梨叶片再生苗生根的适宜组合为1/4MS+0.3 mg·L-1 IBA+ sucrose 30 g·L-1,暗培养7d。 2.梨叶柄再生困难,试验首次从八月红和水晶梨叶柄诱导出不定芽。 植物激素对梨叶柄再生有重要影响。细胞分裂素TDZ适宜于叶柄再生,ZT对叶柄再生没有作用,TDZ与生长素IBA、IAA和NAA的不同组合,可明显影响叶柄再生效率。培养基附加AgNO3
论文目录:
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 果树遗传转化研究进展
1.1.1 果树遗传转化方法
1.1.1.1 农杆菌介导法(Agrobacterium-mediated transformation)
1.1.1.2 基因枪转化法(Microprojectile bombardment)
1.1.1.3 其它转化方法
1.1.2 影响果树遗传转化的主要因素
1.1.2.1 农杆菌的侵染能力
1.1.2.2 转化受体材料
1.1.2.3 农杆菌vir基因的活化
1.1.3 植物基因工程在果树品种改良中的应用
1.1.3.1 培育抗病虫害新品种
1.1.3.2 改良果实性状
1.1.3.3 培育矮化品种
1.1.3.4 其它性状的改良
1.1.3.5 展望
1.2 梨再生体系研究进展
1.2.1 叶片培养
1.2.1.1 基因型
1.2.1.2 培养基类型
1.2.1.3 植物激素种类及配比
1.2.1.4 外植体和处理方式
1.2.1.5 暗培养
1.2.1.6 碳源
1.2.1.7 其它
1.2.2 花药培养
1.2.3 原生质体培养
1.2.4 小结
1.3 梨遗传转化研究进展
1.3.1 梨遗传转化进展情况
1.3.1.1 转化方法和受体材料
1.3.1.2 农杆菌菌株
1.3.1.3 转化的外源基因
1.3.1.4 转化的品种和砧木
1.3.1.5 其它方面
1.3.2 问题和展望
1.4 几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因及其应用研究
1.4.1 几丁质酶的特性和作用原理
1.4.2 β-1，3-葡聚糖酶的特性和作用原理
1.4.3 几丁质酶和β-1，3-葡聚糖在抗真菌病害中的应用
1.5 本试验研究目的和意义
第二章 梨离体再生体系的建立研究
2.1 材料和方法
2.1.1 试验材料
2.1.2 培养基
2.1.3 无菌材料的建立
2.1.4 试管苗继代
2.1.5 叶片再生
2.1.5.1 叶片离体培养
2.1.5.2 叶片再生不定芽增殖
2.1.5.3 叶片再生苗生根
2.1.6 叶柄再生
2.1.7 不带腋芽的节间茎段再生
2.1.8 培养条件
2.1.9 有关指标的调查方法
2.1.9.1 叶片、叶柄和节间茎段再生效率
2.1.9.2 增殖倍数、生根率和平均生根数
2.2 结果与分析
2.2.1 叶片再生
2.2.1.1 叶片外植体的大量获取研究
2.2.1.2 叶片不定芽再生的动态过程
2.2.1.3 叶片再生培养基初步筛选
2.2.1.4 不同暗培养时间对叶片再生不定芽的影响
2.2.1.5 叶片接种方式对叶片再生不定芽的影响
2.2.1.6 叶片外植体类型对梨叶片再生不定芽的影响
2.2.1.7 不同激素配比对八月红和水晶梨叶片再生的影响
2.2.1.8 不同激素配比对砀山酥和红茄梨叶片再生的影响
2.2.1.9 品种基因型对叶片再生的影响
2.2.1.10 不同质量浓度AgNO_3对叶片再生的影响
2.2.1.11 不同质量浓度蔗糖对叶片再生的影响
2.2.1.12 培养基的pH值对叶片再生的影响
2.2.1.13 不定芽增殖
2.2.1.14 叶片再生苗生根
2.2.2 叶柄再生
2.2.2.1 叶柄不定芽再生的过程
2.2.2.2 激素对梨叶柄再生的影响
2.2.2.3 不同质量浓度AgNO_3对梨叶柄再生的影响
2.2.2.4 不定芽的增殖和生根
2.2.3 不带腋芽的节间茎段再生
2.2.3.1 茎段不定芽再生的过程
2.2.3.2 不同激素配比对茎段再生的影响
2.2.3.3 不定芽增殖和生根
第三章 农杆菌介导的梨遗传转化研究
3.1 材料和方法
3.1.1 植物材料
3.1.2 实验菌株
3.1.3 培养基和试剂
3.1.4 选择性抗生素敏感性试验
3.1.4.1 Km敏感性试验
3.1.4.2 Nm敏感性试验
3.1.5 抗菌素浓度的选择
3.1.6 农杆菌介导基因转化
3.1.6.1 菌种保存
3.1.6.2 农杆菌培养
3.1.6.3 侵染
3.1.6.4 转化芽的筛选与植株再生
3.1.7 转基因植株的检测
3.1.7.1 转化植株对Km的抗性分析
3.1.7.2 植物总DNA的提取
3.1.7.3 质粒DNA的提取
3.1.7.4 PCR检测
3.1.7.5 Southern杂交检测(Dot blotting)
3.2 结果与分析
3.2.1 Km对梨叶片再生的影响
3.2.2 Nm对梨叶片再生的影响
3.2.3 Nm对梨茎尖生长和增殖的影响
3.2.4 Cef对梨叶片再生的影响
3.2.5 农杆菌浓度对梨转化的影响
3.2.6 农杆菌感染时间对梨转化的影响
3.2.7 共培养对梨转化的影响
3.2.7.1 共培养时间对梨转化的影响
3.2.7.2 共培养的培养基类型对梨转化的影响
3.2.8 添加AS对梨转化的影响
3.2.9 选择方式对梨转化的影响
3.2.10 以梨节间茎段为受体材料的遗传转化
3.2.11 转化芽的获得和筛选
3.2.12 转化植株的生根检测
3.2.13 转化植株的PCR检测
3.2.14 转化植株的Southern杂交检测
第四章 讨论
4.1 影响梨离体叶片再生的内部因子
4.2 影响梨离体叶片再生的外部因子
4.3 梨叶片再生苗生根
4.4 梨叶柄和节间茎段再生
4.5 离体再生体系对转化的影响
4.6 外植体的脱菌培养
4.7 转化体的选择培养
4.8 关于提高梨离体再生和遗传转化效率
第五章 结论
5.1 梨离体再生
5.2 梨遗传转化
参考文献
致谢
个人简介
发布时间: 2007-04-06
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