7个猪胎盘通透性相关基因的分离、定位、表达分析及其多态检测

论文摘要

猪胎儿的发育依赖于母体营养供给,母体和胎儿之间的物质运输是通过胎盘进行的。影响母体和胎儿之间物质运输的因素主要有胎盘表面血管的密度和通透性以及胎盘面积。胎盘表面血管的生长及其调控与多种细胞因子有关。血管内皮生长因子（VEGF）是一个主要的促进血管生长、舒张和增加血管通透性的调节子。VEGF基因的表达增加能够激活其酪氨酸激酶受体VEGFR1和VEGFR2,诱导VEGFR信号转导通路的下游目标基因内皮一氧化氮合酶（eNOS）和血管内皮钙粘蛋白（CDH5）活性,促进血管内皮细胞的增殖和增加血管通透性。本研究以人、鼠和牛的VEGF,VEGFR1,VEGFR2,eNOS,iNOS,ARRB2,CDH5基因为基础,通过比较基因组学和生物信息学等方法克隆了猪VEGF,VEGFR1,VEGFR2,eNOS,iNOS,ARRB2,CDH5基因的部分cDNA序列;采用RT-PCR和荧光定量PCR方法研究了这7个基因的组织表达和时空表达规律;并且以大白猪为研究对象,采用测序和PCR-RFLP等方法检测iNOS基因的多态性及其与生产和繁殖性状的关系。主要研究结果如下:1.采用同源克隆和电子克隆相结合的方法克隆了猪VEGF,VEGFR1,VEGFR2,eNOS,iNOS,ARRB2,CDH5基因部分cDNA序列,提交NCBI获得收录号EU714324,EU714325,EU714326,EU714327,EU274294,EU714330,EU714329,推导出的氨基酸序列与来自EMBL和GenBank数据库的其他物种蛋白序列进行比对,并用DNAMAN软件对VEGF,VEGFR1,VEGFR2,eNOS,iNOS,ARRB2,CDH5基因作了进化树分析。2.根据基因内含子区域设引物后利用辐射杂种板技术对VEGF,VEGFR1和VEGFR2基因进行了染色体定位,结果表明它们分别定位在7q11-q12、11p13以及8p12区域。上述3个基因的定位结果皆与人基因组中相应基因的染色体位置相对应。3.利用RT-PCR方法检测了VEGF,VEGFR1,VEGFR2,eNOS,iNOS,ARRB2,CDH5基因在长白猪90d胚胎的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、胎盘七个组织的表达水平,结果表明VEGF,VEGFR1,VEGFR2,eNOS,iNOS,ARRB2,CDH5基因在长白猪90d胚胎的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、胎盘七个组织中均广泛表达。4.利用实时荧光定量PCR方法检测了VEGF,VEGFR1,VEGFR2,eNOS,iNOS、CDH5和ARRB2基因在不同妊娠时期和不同品种猪胎盘中的表达水平差异。结果表明VEGF和ARRB2基因在长白猪妊娠33d到90d胎盘表达趋势上调（p＜0.05）;VEGF,VEGFR1,VEGFR2和eNOS基因在二花脸妊娠90d胎盘中表达水平与在长白猪妊娠90d胎盘的表达相比均显著升高（p＜0.01）,CDH5和ARRB2基因表达水平在二花脸妊娠90d胎盘中与在长白猪妊娠90d胎盘的表达相比显著降低（p＜0.01）。5.发现在猪iNOS基因编码区中存在一个A/C的碱基突变位点导致编码氨基酸由谷氨酸变为丙氨酸,利用PCR-Bsh1236Ⅰ-RFLP方法在295头大白猪中进行相关分析表明该突变位点与全程日增重有显著相关（p＜0.05）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表（ABBREVIATIONS）
• 1 前言
• 1.1 研究问题的由来
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 胎盘的血管生成及其调控
• 1.2.2 VEGF受体系统及其信号通路研究进展
• 1.2.2.1 VEGF及其受体基因特征
• 1.2.2.2 VEGF的生物学效应及其胞内信号转导途径
• 1.2.3 VEGF信号通路下游基因研究进展
• 1.2.3.1 NOS基因家族研究进展
• 1.2.3.2 CDH5和ARRB2基因研究进展
• 1.2.4 不同猪种胎盘效率比较及胎盘发育相关基因研究进展
• 1.3 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 样品
• 2.1.1.1 猪基因组DNA样品
• 2.1.1.2 用于基因染色体定位的DNA样品
• 2.1.1.3 基因表达分析的组织样品
• 2.1.2 菌株和克隆载体
• 2.1.3 主要试剂与耗材
• 2.1.3.1 主要试剂及耗材来源
• 2.1.3.2 试剂及缓冲液配制
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 主要分子生物学网站及所用软件
• 2.2 方法
• 2.2.1 候选基因的cDNA克隆
• 2.2.1.1 目标基因的生物信息学分析
• 2.2.1.2 引物设计
• 2.2.1.3 总RNA的提取、质量检测与纯化
• 2.2.1.4 cDNA样品的准备
• 2.2.1.5 RT-PCR扩增
• 2.2.1.6 产物的纯化、克隆与测序
• 2.2.1.7 cDNA序列分析
• 2.2.2 基因染色体定位的SCHP和RH方法
• 2.2.2.1 基因定位的引物设计
• 2.2.2.2 PCR分型方法
• 2.2.2.3 数据分析方法
• 2.2.3 基因的表达谱研究
• 2.2.3.1 半定量RT-PCR
• 2.2.3.2 实时定量PCR技术
• 2.2.4 基因的多态性检测及其与性状的关联分析
• 2.2.4.1 目标基因SNPs扫描方法
• 2.2.4.2 利用PCR-RFLP方法检测目标基因的多态性
• 2.2.4.3 基因多态与经济性状的关联分析
• 3 实验结果
• 3.1 基因克隆与序列分析
• 3.1.1 猪VEGF基因cDNA的克隆与序列分析
• 3.1.2 猪VEGFR1基因cDNA的克隆与序列分析
• 3.1.3 猪VEGFR2基因cDNA的克隆与序列分析
• 3.1.4 猪eNOS基因cDNA的克隆与序列分析
• 3.1.5 猪CDH5基因cDNA的克隆与序列分析
• 3.1.6 猪ARRB2基因cDNA的克隆与序列分析
• 3.1.7 猪iNOS基因cDNA的克隆与序列分析
• 3.2 染色体定位
• 3.2.1 VEGF染色体定位
• 3.2.2 VEGFR1染色体定位
• 3.2.3 VEGFR2染色体定位
• 3.3 基因表达分析
• 3.3.1 基因的组织表达谱分析
• 3.3.2 基因时空表达分析
• 3.4 iNOS基因的多态检测及性状关联分析
• 4 讨论
• 4.1 关于基因克隆
• 4.2 关于基因染色体定位
• 4.3 关于基因表达分析
• 4.3.1 关于基因的组织表达谱分析
• 4.3.2 关于基因在猪胎盘不同时期和不同猪种的表达分析
• 4.4 关于基因的SNPs检测及性状的关联分析
• 5 小结
• 5.1 本研究获得的结果及创新点
• 5.2 下一步工作
• 参考文献
• 在读期间发表的论文或摘要题录
• 致谢
• 附录