珙桐产黄酮内生真菌的分离及鉴定

论文摘要

珙桐(Davidia involucrate Baill.)为我国特有的第三纪古热带植物的孑遗树种,被列为我国一级保护植物。研究表明,珙桐叶提取物中含有槲皮素、山奈酚等黄酮类物质。本研究从内生真菌的角度出发,对珙桐中的内生真菌进行研究,结果如下:1、采用组织分离法从珙桐组织中分离了126株内生真菌。经对比实验,内生真菌分离时,植物组织的表面消毒以75%酒精和0.1%升汞结合的方法较好;对珙桐茎部的升汞消毒时间以4～5min为宜,珙桐叶子的升汞消毒时间应控制在2min左右。珙桐中分离到的126株内生真菌主要分布在树叶和茎中。2、以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coil)为测试菌种,对初选的126株珙桐内生真菌进行代谢产物活性筛选。其产物对三种细菌的抑菌率分别为65%、71%、25%,其中D37菌株对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。3、对具抑菌活性的菌株D37进行液体发酵。经高效液相色谱(High PerformanceLiquid Chromatography,HPLC)分析证明菌株D37的次生代谢产物中含有槲皮素、山奈酚二种黄酮类物质,每100g干菌丝可产黄酮31.9mg/100g。4、根据菌株D37的形态学特征,结合核糖体内部转录序列(intemal transcribedspacer,ITS)的测定结果,确定菌株D37为曲霉属,烟曲霉种(Aspergillus fumigatus)。本文从珙桐分离的产黄酮内生真菌D37即可作为生产黄酮类药物的候选菌株,此外,分离到的126株内生真菌是进一步进行分离其它生物活性物质、进行抗菌及药物等研究的资源库。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 珙桐植物简介
• 1.2 植物内生真菌及其次生代谢产物的研究进展
• 1.2.1 内生真菌的起源、分布及其生物多样性
• 1.2.2 内生真菌生态学
• 1.2.2.1 内生真菌的生态类群
• 1.2.2.2 内生真菌的寄主专一性
• 1.2.2.3 内生真菌的组织专一性
• 1.2.3 植物内生真菌的生物学及生态学作用
• 1.2.3.1 促进宿主的生长
• 1.2.3.2 增加宿主对环境胁迫的抗性
• 1.2.3.3 增加宿主植物的他感作用
• 1.2.4 植物内生真菌的活性代谢产物的研究
• 1.2.4.1 抗生素类
• 1.2.4.2 杀昆虫物质类
• 1.2.4.3 植物生长调节剂类
• 1.2.4.4 抗肿瘤活性物质类
• 1.2.4.5 黄酮类物质的药理作用机制
• 1.2.5 分子生物学技术在内生真菌研究中的应用
• 1.2.5.1 现阶段内生真菌研究的一般方法
• 1.2.5.2 分子生物学技术的引入
• 1.2.5.3 应用分子生物学技术在内生真菌研究中发现的新问题
• 2 研究的目的和意义
• 3 实验材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 供试细菌:
• 3.2 试剂
• 3.2.1 试剂的配制及灭菌
• 3.2.1.1 培养基的配制
• 3.2.2 试剂的配制:
• 3.2.3 抗生素用法与用量:
• 3.3 实验仪器
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 珙桐组织的采样
• 3.4.2 内生真菌的分离:
• 3.4.3 内生真菌的纯化
• 3.4.4 内生真菌的形态学鉴定方法
• 3.4.5 保存方法
• 3.4.6 内生真菌产黄酮的提取
• 3.4.7 抑菌试验
• 3.4.7.1 菌种活化
• 3.4.7.2 菌悬液的制备
• 3.4.7.3 最低抑菌浓度的测定
• 3.4.7.4 纸片扩散法检测
• 3.4.8 内生真菌活性代谢产物的鉴定
• 3.4.8.1 薄层层析法
• 3.4.8.2 高效液相色谱法
• 3.4.8.3 内生真菌菌株D37产黄酮类物质的产率
• 3.4.9 产孢结构的形态学鉴定
• 3.4.10 ITS序列的扩增、克隆和测序
• 3.4.10.1 DNA的提取
• 3.4.10.2 琼脂糖凝胶电泳
• 3.4.10.3 胶回收:
• 3.4.10.4 PCR的扩增和克隆:
• 3.4.10.5 DNA的连接
• 3.4.10.6 感受态细胞的制备及转化
• 3.4.10.7 阳性菌落的筛选与鉴定
• 4 结果
• 4.1 消毒剂及消毒时间的确定
• 4.2 珙桐内生真菌的筛选
• 4.3 内生真菌代谢产物的抑菌作用
• 4.4 高效液相色谱
• 4.5 内生真菌的形态鉴定
• 4.6 ITS的扩增
• 4.7 ITS的核苷酸序列测定及分析
• 5 讨论
• 5.1 内生真菌的分离
• 5.2 内生真菌分离方法的有效性
• 5.3 珙桐不同组织中内生真菌数量分布的探讨
• 5.4 内生真菌的活性代谢产物抑菌研究
• 5.5 内生真菌代谢产物的鉴定
• 5.6 珙桐内生真菌D37菌株的鉴定
• 5.7 内生真菌与植物的关系
• 6 小结
• 参考文献
• 致谢