寡肽类药物与DNA的相互作用及人寡肽转运蛋白2表达初探

论文摘要

寡肽一般具有较强的生物活性,多数可作为药物或药物前体。而人寡肽转运蛋白（hPepT2）是一种高亲和力、低容量的跨膜转运蛋白,它不仅能转运二、三肽而且还能转运β-内酰胺类抗生素、血管紧张素转换酶抑制剂等许多仿肽类药物。研究寡肽类化合物与DNA的相互作用有助于从分子水平上了解药物的作用机理,可为设计更有效的药物提供指导,在化学、生物学和医学中具有重要的理论意义和应用价值。利用固相合成法合成了两个寡肽类化合物及三个生物活性肽,依次是丙戊酰酪氨酸二肽（VPA-Tyr-Tyr）、丙戊酰组氨酸二肽（VPA-His-His）、免疫调节肽β-酪蛋白Tyr-Leu-Leu、ACE抑制肽Ala-Ala-Leu及ACE抑制肽Ala-Ala-Val,粗产率均达到85%以上。并利用反相高效液相色谱,以乙腈-水为流动相,以C18半制备柱实现了VPA-Tyr-Tyr和VPA-His-His的分离和纯化,并利用ESI-MS、IR、1H NMR和13C NMR对产物进行了表征。采用紫外可见光谱法、荧光光谱法、电泳法研究了两个寡肽类化合物与DNA的相互作用,考察了浓度与时间对二者相互作用的影响。结果表明,VPA-Tyr-Tyr及VPA-His-His和DNA的相互作用情况相似,二者之间的作用模式主要为嵌入模式,伴随着静电作用;且与pUC18没有发生切割作用。以hPepT2 cDNA为模板,扩增得到hPepT2目的基因,将目的基因与pMD18-T simple载体连接,经测序正确后克隆至表达载体pET-30a,分别转化入E.coli BL21（DE3）与Transetta（DE3）的感受态细胞,得到的转化子经IPTG诱导表达,探索了IPTG浓度、诱导时间和温度对目的蛋白表达的影响。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示没有目的蛋白的条带出现,建议进行基因优化或者分段表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 多肽的合成与纯化
• 1.1.1 多肽的合成
• 1.1.2 多肽的分离及分析方法
• 1.2 小分子与DNA 的相互作用方式与研究方法
• 1.2.1 小分子与DNA 的相互作用方式
• 1.2.2 小分子与DNA 的相互作用研究方法
• 1.3 寡肽转运蛋白（hPepT2）
• 1.3.1 hPepT2 的分布、结构功能和作用机制
• 1.3.2 PepT2 与药物的相互作用
• 1.3.3 总结与展望
• 1.4 本课题研究的意义及主要内容
• 第二章 寡肽类药物分子的合成及表征
• 2.1 实验部分
• 2.1.1 仪器和试剂
• 2.1.2 质谱条件
• 2.1.3 实验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 固相合成
• 2.2.2 丙戊酰酪氨酸二肽的合成及表征
• 2.2.3 丙戊酰组氨酸二肽的合成与表征
• 2.2.4 免疫调节肽β-酪蛋白Tyr-Leu-Leu 合成
• 2.2.5 ACE 抑制肽Ala-Ala-Leu 合成与表征
• 2.2.6 ACE 抑制肽Ala-Ala-Val 的合成
• 第三章 药物分子与DNA 相互作用研究
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 仪器与试剂
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 丙戊酰酪氨酸二肽与DNA 相互作用的紫外光谱研究
• 3.2.2 丙戊酰酪氨酸二肽与DNA 相互作用的荧光光谱研究
• 3.2.3 丙戊酰酪氨酸二肽与DNA 相互作用的电泳法研究
• 3.2.4 丙戊酰组氨酸二肽与DNA 相互作用的紫外光谱研究
• 3.2.5 丙戊酰组氨酸二肽与DNA 相互作用的荧光光谱研究
• 3.2.6 丙戊酰组氨酸二肽与DNA 相互作用的电泳法研究
• 第四章 人寡肽转运蛋白2 的原核表达
• 4.1 实验材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 PCR 扩增目的片段
• 4.2.2 重组子BamH I 与Nde I 双酶切及测序分析
• 4.2.3 构建表达子Ⅰ及表达子Ⅰ双酶切鉴定测序分析
• 4.2.4 表达子Ⅰ的IPTG 诱导表达
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历