产甲壳素酶菌株的筛选、发酵条件优化和酶学性质研究

论文摘要

本研究是从土壤中分离筛选得到菌株D和菌株S,研究表明,混合发酵培养其产酶的能力显著的提高,其产酶最适培养基组分为（%,w/v）:尿素1.0, K2HPO4 0.07, KH2PO4 0.03,MgSO4 0.05,酵母粉0.5,甲壳素1.0。摇瓶发酵条件:pH5.5,2%（v/v）接种量,32℃,130rpm培养72 h,500mL锥形瓶培养基装量为100mL。在最适产酶发酵条件下,甲壳素酶活力可达到1.19 U/mL。采用40%-80%（NH4）2SO4分级盐析、透析脱盐、甲壳素亲和层析、Sephadex G-75凝胶过滤等分离纯化技术,获得了纯化的甲壳素酶。制品经过SDS-PAGE电泳,该甲壳素酶呈单一条带,分子量约为45kD。对该酶进行部分酶学性质的研究表明:该甲壳素酶的最适作用温度为60℃,最适反应pH为pH5.0;最适反应底物为粉末甲壳素;金属离子Fe2+,Mn2+对酶活力有明显的促进作用,Cu2+、Zn2+则对酶活力具有明显的抑制作用;该酶除能降解甲壳素,对壳聚糖和羧甲基甲壳素也有一定的降解作用。该酶有较好的稳定性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0 前言
• 1 绪论
• 1.1 甲壳素和壳聚糖
• 1.2 甲壳寡糖和壳寡糖
• 1.2.1 甲壳寡糖和壳寡糖的性质
• 1.2.2 甲壳寡糖和壳寡糖的应用
• 1.3 甲壳寡糖和壳寡糖的制备工艺
• 1.3.1 化学法
• 1.3.2 糖转移法
• 1.3.3 酶降解法
• 1.4 甲壳素酶（chitinase）
• 1.4.1 概述
• 1.4.2 甲壳素酶的分类
• 1.4.3 甲壳素的酶水解机理及动力学研究进展
• 1.4.4 甲壳素酶的应用
• 1.5 发酵技术
• 1.6 国内外研究现状
• 2 产甲壳素酶菌株的筛选
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要实验原料及试剂
• 2.1.2 主要设备
• 2.1.3 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 产甲壳素酶菌株筛选
• 2.2.2 甲壳素酶活力的测定
• 2.3 筛得菌株的菌种鉴定
• 2.3.1 PCR 法扩增细菌的 16S rDNA 基因
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 产甲壳素酶菌株筛选结果
• 2.4.2 菌种鉴定
• 2.5 讨论
• 2.6 本章小结
• 3 产甲壳素酶菌株的发酵条件优化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 仪器与试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 测定甲壳素酶活力
• 3.2.2 菌种保藏
• 3.2.3 产酶条件研究
• 3.2.4 发酵罐培养
• 3.3 发酵条件优化
• 3.3.1 混合发酵对产酶的影响
• 3.3.2 不同氮源对产酶的影响
• 3.3.3 不同碳源对产酶的影响
• 3.3.4 培养基起始 pH 对产酶的影响
• 3.3.5 接种量对产酶的影响
• 3.3.6 装瓶量对产酶的影响
• 3.3.7 培养时间对产酶的影响
• 3.4 产甲壳素酶菌株的上罐发酵
• 3.5 发酵条件优化的讨论
• 3.5.1 单次单因子发酵条件的优化
• 3.5.2 混合发酵
• 3.5.3 优化效果
• 4 甲壳素酶的分离纯化
• 4.1 菌种来源
• 4.2 仪器与试剂
• 4.3 测定方法
• 4.4 酶的分离纯化
• 4.4.1 甲壳素粗酶的制备
• 4.4.2 粗酶的进一步分离纯化
• 4.5 实验结果
• 4.6 讨论
• 5. 甲壳素酶酶学性质的初步研究
• 5.1 各种因素对甲壳素酶活性的影响
• 5.1.1 酶反应的最适温度
• 5.1.2 酶反应的最适 pH
• 5.1.3 不同底物对酶反应活性的影响
• 5.1.4 不同处理方式的甲壳素作为底物对酶反应活性的影响
• 5.1.5 不同底物量对酶反应活性的影响
• 5.1.6 金属离子对酶反应活性的影响
• 5.1.7 温度对酶稳定性的影响
• 5.1.8 pH 对酶稳定性的影响
• 5.2 甲壳素酶的酶解产物的初步研究
• 5.2.1 酶解寡糖的制备
• 5.2.2 硅胶板薄层层析
• 5.3 实验结果
• 5.4 酶学性质的讨论
• 6 本文小结
• 参考文献
• 致谢