小反刍兽疫（PPR）ELISA及PCR诊断方法的建立

论文摘要

小反刍兽疫（Peste des Petits Ruminants，PPR）是由副粘病毒科麻疹病毒属小反刍兽疫病毒引起的一种山羊和绵羊的急性或亚急性病毒病，临床上以高热、坏死性胃炎、胃肠炎和肺炎为特征。该病首次报道是在科特迪瓦，现发生在撒哈拉以南和赤道以北的多数非洲国家，中东到土耳其的几乎全部国家。近年来该病持续向东传播，我国周边的印度、尼泊尔等国家也先后爆发了小反刍兽疫。我国与印度、尼泊尔等国家有很长的边境线，这些边境地区有高原、山地及荒地的存在，存在着多种野生小反刍兽，在周边国家感染PPRV后，经迁徙将PPRV存入我国的可能性很大。PPR爆发将会影响我国的养羊业，同时也会对包括2008年奥运会吉祥物的藏羚羊在内的多种濒危野生动物造成打击。为防范小反刍兽疫传入我国，应首先建立小反刍兽疫的诊断技术。PPR诊断方法主要包括血清学诊断方法和病原学诊断方法。血清学诊断方法中应用最多的ELISA方法，而病原学诊断方法中使用最为广泛的则是PCR方法。本论文先后建立了以PPRV N蛋白为抗原的ELISA试验和以N蛋白为靶蛋白的RT-PCR技术。本论文主要包括以下几方面的研究工作：1 PPRV N基因的合成与N蛋白的表达从GenBank中下载多株PPRV病毒的N基因片断序列，用MegAlign软件分析它们的进化关系，选取PPRV Turkey 2000株基因组全序列（序列号为AJ849636）作为模板，截取N基因CDS序列（108-1685）；根据大肠杆菌密码子偏好调整密码子，并改变基因编码区内NcoⅠ和HindⅢ的酶切位点处的碱基组成。确定序列后经公司合成，获取了PUC-PPRV-N质粒；用NP1和NP2引物大量扩增PPRV-N基因，并提取pET32-H质粒。提取的pET32-H质粒和回收的PPRV-N基因PCR产物用NcoⅠ和HindⅢ酶进行双酶切，并回收目的片段；在T4DNA连接酶的作用下，纯化的PPRV-N基因和pET32-H载体进行连接反应，构建了含有PPRV N基因的重组质粒pET32-PPRV-N；将pET32-PPRV-N大肠杆菌菌种接于含氨卞青霉素（AMP）的LB固体培养基上，经诱导后可以表达出分子量约65000的蛋白；表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blotting检测，可鉴定为PPRV N蛋白。2 PPRV N蛋白的纯化与间接ELISA方法的建立菌种经37℃震荡培养后，测OD值，当OD值达到0.5-0.6时，加入IPTG终浓度为1mol／L，37℃经4h诱导表达。将菌液离心，菌体沉淀用1×binding buffer悬浮，超声波裂解，离心取上清，加入已处理好的层析柱，以每h10倍柱体积的流量过柱。随后分别用10倍体积1xBinding Buffer、6倍体积1xWashBuffer、6倍体积1xELute Buffer洗涤层析柱，收集1xELute Buffer的洗脱液，加入超滤管中进行浓缩与除盐，经蛋白核酸测定仪上进行浓度后将蛋白分装保存备用。制备免疫血清，用国际标准阳性血清进行标定，按照标定的梯度稀释后作为参考阳性血清。以PPRV N蛋白为抗原包被酶标板，形成了最终的ELISA程序。PBS稀释纯化好的PPRV-N蛋白，使其终浓度为3ug／ml；37℃作用3h后4℃包被过夜，次日用0.1％BSA 37℃封闭1h；待检血清用0.1％BSA-PBST作1：40稀释，加入包被板，37℃作用40min；酶标蛋白G作1：10000稀释后，加入包被板，37℃作用40min；加入TMB底物37℃作用15min后用H2OS4终止反应；测定OD450值，计算每一样品的S／P值并判定结果。从山东省地方采集467份羊血清，使用建立的ELISA程序进行检测，计算不同血清的样品OD450值／阳性参考血清OD450值（S／P）值，S／P值用平均值加3倍标准差，计算出其临界点为0.27。同时应用I-ELISA方法和C-ELISA方法检测来自于疫区的69份血清。两者之间的符合率为79.7％（（8+47）／69）；与用以病毒裂解物为抗原、H蛋白的单抗为基础的C-ELISA方法相比较，我们的PPRV重组N蛋白间接ELISA方法的特异性为94％（47／50），敏感性为42％（8／19）。3 PPRV N基因的反转录RT-PCR程序的建立培养含有PPRV N基因片断的大肠杆菌JM109，使用碱裂解法提取小量PUC-PPRV-N质粒，以N基因的前20个碱基作为上游引物（NP1），最后20个碱基的反向序列作为下游引物（NP2）大量扩增PPRV-N基因；使用小量胶回收试剂盒法回收PPRV-N基因，连接到pGEM-T载体；将连接产物pGEM-T-PPRV-N转化至E．coli DH5a感受态细胞中，并使用蓝白斑试验筛选重组质粒，培养pGEM-T-PPRV-N大肠杆菌；用碱裂解法提取小量pGEM-T-PPRV-N质粒，PeR鉴定后选用Nde I对质粒酶切，进行线性化处理，用酚／氯仿法纯化线性化质粒；测定DNA含量后，用纯化后的线性化质粒作为模板进行体外转录，转录产物纯化后测定其含量，稀释后使其拷贝数最终达到2μL中6×1010个，分装冻存于-80℃后即为RNA阳性对照。用体外转录产物作为模板，以NP3和NP4作为上下游引物，对PCR反应的复性温度、循环次数、Mg2+浓度、引物浓度等进行优化，确定最佳的PCR反应条件为25μL体系。各反应成分为2.5μL 10×Taq酶缓冲液、2.0μL dNTP、1.0μL MgCl2、1.0μL NP3、1.0μL NP4、1.0μL模板、1.0μL AMV、1.0μL RNase、0.25μL Taq酶、14.25μLDEPC水。PCR仪程序设置为42℃反转录40min；95℃预变性3min，然后95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，扩增40个循环之后，72℃延伸7min。提取和犬瘟热、新城疫病毒的RNA作为模板，以体外转录的模板作为阳性对照，结果仅见体外转录模板有扩增，证实了试验的特异性。阳性对照的体外转录产物用DEPC水进行连续10倍倍比稀释后，分别进行PCR扩增，结果PPRV RT-PCR的敏感性为可以检出拷贝数为40的PPRV。上述研究结果表明：本研究合成了PPRV N基因，表达和纯化了PPRV N蛋白，建立了PPRV N蛋白的间接ELISA方法，该ELISA方法与以抗H蛋白单抗为基础构建的C-ELISA相比较，两者的符合率为79.7％；反转录了PPRV N基因作为阳性对照，以NP3和NP4为引物，建立了PPRV RT-PCR方法。上述PPRV ELISA诊断方法和PCR诊断方法的建立，使我国初步具备了检测PPRV感染的能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 文献综述
• 第一节 小反刍兽疫及其分子流行病学研究进展
• 1 临床症状
• 2 病理变化
• 3 病原学
• 4 PPR病毒全基因序列及其基因变异特性
• 第二节 小反刍兽疫免疫学诊断方法及疫苗免疫研究进展
• 1 病毒蛋白
• 2 病原诊断技术
• 3 血清学诊断技术
• 4 疫苗的研制
• 第三节 小反刍兽疫（PPR）传入我国的风险分析
• 1 地理分布
• 2 小反刍兽疫的传播途径
• 3 小反刍兽疫易感动物
• 4 小反刍兽疫对我国的危害确认
• 5 小反刍兽疫传入我国的途径及各途径的风险分析
• 6 小反刍兽疫传入我国的风险控制
• 7 我国防控小反刍兽疫存在的问题
• 8 我国防止PPR应采取的措施
• 第四节 本研究的目的和意义
• 第二章 PPRV N基因的合成与表达
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 菌种、载体
• 1.3 主要试剂
• 1.4 pET-32H质粒
• 1.5 PPRV N基因的合成
• 1.6 引物合成
• 1.7 大肠杆菌JM109的培养
• 1.8 PUC-PPRV-N质粒的提取（碱裂解法）
• 1.9 PUC-PPRV-N质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定
• 1.10 PUC-PPRV-N大肠杆菌JM109和质粒的PCR鉴定
• 1.11 PPRV-N基因的大量扩增
• 1.12 小量胶回收试剂盒法回收PCR产物PPRV-N基因
• 1.13 pET32-H质粒的提取与电泳鉴定
• 1.14 pET32-H质粒和PCR产物的双酶切及回收
• 1.15 PPRV-N基因和pET32-H质粒大片断的连接
• 1.16 感受态细胞的制备
• 1.17 pET32-H连接产物的转化
• 1.18 大肠杆菌pET32-PPRV-N DH5 α 的培养
• 1.19 pET32-PPRV-N质粒的提取
• 1.20 重组质粒pET32-PPRV-N的鉴定
• 1.21 PPRV-N基因的诱导表达
• 1.22 重组质粒表达产物的SDS-PAGE鉴定
• 1.23 Western-blotting检测鉴定
• 2 结果
• 2.1 PPRV N基因的合成
• 2.2 PUC-PPRV-N质粒的的琼脂糖凝胶电泳鉴定
• 2.3 PUC-PPRV-N大肠杆菌JM109和质粒的PCR鉴定
• 2.4 pET32-H质粒电泳鉴定结果
• 2.5 重组质粒pET32-PPRV-N的鉴定
• 2.6 重组质粒表达产物的SDS-PAGE鉴定
• 2.7 Western-blotting检测鉴定
• 3 讨论
• 3.1 我国建立PPRV诊断方法的必要性
• 3.2 PPRV诊断试剂及PPRV N蛋白的选择
• 3.3 PPRV N基因的合成
• 4 小结
• 4.1 PPRV N基因的合成
• 4.2 重组质粒pET32-PPRV-N的构建
• 4.3 PPRV N蛋白的表达与鉴定
• 第三章 小反刍兽疫间接ELISA方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 诱导表达条件的优化
• 1.3 表达产物可溶性处理方法的选择
• 1.4 pET-PPRV-N蛋白表达产物的纯化
• 1.5 参考阴性血清的制备
• 1.6 参考阳性血清的制备
• 1.7 间接ELISA方法的建立
• 2 结果
• 2.1 pET32-PPRV-N诱导表达条件的优化结果
• 2.2 表达产物可溶性处理方法的选择
• 2.3 纯化方案的选择结果
• 2.4 蛋白的浓缩与除盐
• 2.5 参考阳性血清制造结果
• 2.6 间接ELISA方法的建立
• 2.7 ELISA方法临界点的确定
• 2.8 间接ELISA的特异性试验结果
• 2.9 间接ELISA的敏感性与特异性确定结果
• 2.10 重复性试验
• 3 讨论
• 3.1 PPRV N蛋白的纯化
• 3.2 PPRV阳性血清的制备
• 3.3 I-ELISA底物的选择
• 3.4 I-ELISA临界点的确定
• 3.5 与C-ELISA的比较
• 3.6 PPRV N蛋白胶体金试纸条方法的尝试
• 4 小结
• 4.1 PPRV N蛋白的表达与纯化
• 4.2 PPRV N蛋白I-ELISA方法的建立
• 4.3 PPRV I-ELISA与C-ELISA的比较
• 第四章 PPRV N基因RT-PCR检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种、细胞与载体
• 1.2 引物合成
• 1.3 大肠杆菌JM109的培养
• 1.4 PUC-PPRV-N质粒的提取
• 1.5 PPRV-N基因的大量扩增
• 1.6 小量胶回收试剂盒法回收PCR产物PPRV-N基因
• 1.7 pGEM-T载体与PPRV-N基因的连接反应
• 1.8 感受态细胞的制备
• 1.9 pGEM-T连接产物的转化
• 1.10 pGEM-T-PPRV-N质粒的提取
• 1.11 pGEM-T-PPRV-N大肠杆菌和质粒的PCR鉴定
• 1.12 pGEM-T-PPRV-N质粒的线性化处理
• 1.13 线性化质粒的纯化
• 1.14 线性化质粒浓度的测定
• 1.15 体外转录
• 1.16 转录产物的纯化
• 1.17 转录产物浓度的测定
• 1.18 模板RNA标准品的制备
• 1.19 RT-PCR条件的优化
• 1.20 RT-PCR特异性试验
• 1.21 RT-PCR敏感性测定
• 2 结果
• 2.1 PPRV-N基因的大量扩增及小量胶回收结果
• 2.2 pGEM-T-PPRV-N大肠杆菌和质粒的PCR鉴定
• 2.3 pGEM-T-PPRV-N质粒的线性化处理
• 2.4 线性化质粒浓度的测定
• 2.5 转录产物浓度的测定
• 2.6 模板RNA标准品的制备
• 2.7 RT-PCR条件的优化
• 2.8 RT-PCR特异性试验
• 2.9 RT-PCR敏感性测定
• 3 讨论
• 3.1 引物的选择
• 3.2 RNA阳性对照的制备
• 3.3 RT-PCR的特异性
• 4 小结
• 4.1 RT-PCR阳性对照的制备
• 4.2 RT-PCR程序的建立
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 附1 N基因片断的18株PPRV的基本信息
• 附2 SDS-PAGE蛋白电泳所用试剂的配制
• 附3 几株PPRV的N蛋白全氨基酸序列变异情况
• 附4 PPRV H蛋白竞争ELISA的操作
• 附5 RNA模板拷贝数计算方法
• 致谢
• 作者简介