菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）酚氧化酶的分离纯化及其部分生物化学性质的研究

论文摘要

无脊椎动物缺乏真正的抗体,仅具有先天性非特异性免疫系统,查清非特异性免疫物质及细胞的非特异性免疫作用的机制,对提高无脊椎动物的整体免疫功能是至关重要的。酚氧化酶是无脊椎动物非特异性免疫系统中的主要成员之一,在免疫防御中起着关键性作用。业已证明,酚氧化酶原激活系统在无脊椎动物中起着重要的异物识别和防御功能。外来信号按一定顺序最终激活了酚氧化酶原（prophenoloxidase, proPO）而成为有活性的PO,活性PO诱导有关底物由酚变成醌,最终产生黑色素,黑色素沉积到外来物上,通过包被和黑化将其隔离和杀死,以达到免疫的效果,而且黑色素及其代谢中间产物还可抑制病原菌胞外蛋白质和几丁质酶的活性,从而杀死微生物和寄生虫,起到免疫作用。弄清酚氧化酶（EC1.10.3.1）的生物化学性质,进而确定其在免疫防御中的生物学功能及其作用机制,对于无脊椎动物免疫学及其养殖业均具有重要意义。本文以菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）的血淋巴为材料,利用硫酸铵沉淀、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等方法,对PO进行了分离纯化并以L-二羟苯丙氨酸（L-DOPA）为特异性底物对其生物化学性质进行研究。实验发现,proPO的分子量为84.1 kDa左右,在实验操作过程中极易发生降解或自身降解,变成有活性的大小约76.9 kDa的PO,1 %SDS即可使该proPO全部被激活而成为有活性的PO。通过纯化发现2 kg菲律宾蛤仔可以得到0.021 mg PO,纯化的PO特异性活性提高了62.5倍,得率为48%。该PO对L-二羟苯丙氨酸（L-DOPA）发生特异性反应的最适pH值为7.0、最适温度为40℃、Km值约为2.2 mmol/L,而对酪氨酸的Km值则为6.0 mmol/L,说明PO对L-DOPA具有更高的亲和力。多种氧化酶特异性抑制剂对PO纯化样品酶活性的影响结果表明,苯甲酸（benzoic acid）和亚硫酸钠（sodium sulfite）对PO活性具有极强的抑制作用,柠檬酸（citric acid）、苯硫脲（1-phenyl-2-thiourea）、硫脲（thio urea）和半胱氨酸（cysteine）对PO活性也具有很强的抑制作用,而抗坏血酸（ascorbic acid）对PO的抑制作用不显著。结合该PO对酪氨酸等单酚也具有高度特异性的氧化活性,从而证明它是一种酪氨酸酶型的酚氧化酶。此外,该酶对EDTA、DETC和金属离子非常敏感,其活性能被EDTA、DETC和Cu2+等强烈抑制,且10 mmol/L Cu2+能完全回复被DETC抑制的酶活性,表明该酶很可能还是一种铜金属酶（Cu-metalloenzyme）。由此可见,菲律宾蛤仔PO极可能是一种酪氨酸酶型的铜金属酶。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 无脊椎动物免疫学
• 1.1 细胞免疫
• 1.2 体液免疫
• 2 酚氧化酶原激活系统
• 2.1 酚氧化酶原激活系统的研究概况
• 2.2 酚氧化酶原激活系统的激活机制
• 2.2.1 内源性调节机制
• 2.2.2 外源性调节机制
• 3 酚氧化酶与无脊椎动物非特异性免疫
• 3.1 酚氧化酶的性质与结构
• 3.1.1 酚氧化酶的生物化学性质
• 3.1.2 酚氧化酶的分子生物学性质与结构
• 3.2 酚氧化酶在无脊椎动物非特性免疫中的功能
• 3.3 酚氧化酶的进化地位
• 4 本文研究的目的
• 第二章 菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）酚氧化酶的分离纯化
• 1 材料与用品
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器
• 1.3 药品与试剂
• 1.4 几种常用溶液的配方
• 2 方法
• 2.1 酚氧化酶粗品的制备
• 2.2 酶的纯化
• 2.2.1 阴离子交换柱层析
• 2.2.2 凝胶过滤柱层析
• 2.3 酚氧化酶活性测定
• 2.4 酚氧化酶样品SDS 激活方法
• 2.5 SDS-PAGE 电泳
• 2.6 蛋白质浓度测定
• 3 结果
• 3.1 菲律宾蛤仔酚氧化酶的分离纯化
• 3.1.1 离子交换柱层析
• 3.1.2 凝胶过滤柱层析
• 3.2 菲律宾蛤仔 PO 的电泳结果
• 3.3 菲律宾蛤仔PO 的蛋白质含量结果
• 3.4 菲律宾蛤仔PO 的纯化效率
• 4 讨论
• 5 结论
• 第三章 菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum ）酚氧化酶部分生物化学性质和酶性质的研究
• 1 材料与用品
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器和药品
• 1.3 几种溶液的配方
• 2 方法
• 2.1 酚氧化酶活性的测定
• 2.2 温度对酚氧化酶活性的影响
• 2.3 pH 值对酚氧化酶活性的影响
• 2.4 酚氧化酶的酶动力学曲线测定
• 2.5 各种氧化酶抑制剂对酚氧化酶活性的影响
• 2.6 金属离子和EDTA、DETC 对酚氧化酶活性的影响
• 2.7 酚氧化酶活性的回复实验
• 3 结果
• 3.1 酚氧化酶的最适反应温度
• 3.2 酚氧化酶的最适反应pH 值
• 3.3 酚氧化酶的酶动力学曲线
• 3.4 各种氧化酶抑制剂对酚氧化酶活性的影响
• 3.5 EDTA、DETC 和几种金属离子对酚氧化酶活性的影响作用
• 3.6 金属离子对酚氧化酶活性的回复
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的文章
• 致谢