论文摘要
【研究背景】谷氨酸（Glutamate, Glu）兴奋性神经毒性在缺氧-缺血性脑损伤和各种慢性退行性神经病变中起重要作用。如何减轻Glu兴奋性毒性对上述疾病的治疗具有重要意义。研究表明,谷氨酸的兴奋性毒性与一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase, NOS）的过度活化、一氧化氮（Nitric oxide, NO）的生产增加密切相关。非对称性二甲基精氨酸（Asymmetric Dimethylarginine, ADMA）是一种广泛参与多种病理生理过程的内源性竞争性NOS抑制剂。ADMA除能通过抑制NOS活化,减少NO生成外,还能通过诱导NOS失耦联,增加氧自由基（reactive oxygen species, ROS）生成、造成氧化应激损伤。在Glu兴奋性毒性损伤过程中,ADMA是通过抑制NOS活化、减少NO生成,减轻兴奋性神经毒性,还是通过增加ROS生成,加重兴奋性神经毒性,尚无报道。【目的】本试验以Glu损伤PC12细胞作为Glu兴奋性神经毒性的体外模型,探讨ADMA对Glu兴奋性神经毒性作用的影响及其机制。【方法】1)四甲基偶氮唑蓝（3-（4,5-Dimethylthiazol-2yl）-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide, MTT）比色法检测细胞增殖状况;2)乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放试验评价细胞损伤程度;3)罗丹明123（Rhodamine 123, Rh123）染色,荧光显微镜摄片及流式细胞仪（Flow Cytometry, FCM）检测细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）;4)双氢罗丹明（Dihydrorhodamin123, DHR）染色,荧光显微镜摄片及FCM检测细胞内ROS水平;5)NOS检测试剂盒测定细胞NOS活性;6)NO检测试剂盒测定细胞NO的生成。【结果】1. Glu对PC12细胞的兴奋性毒性作用及其机制1) PC12细胞分别与0.5 mM、1 mM、2 mM、4 mM和6 mM Glu共培养24 hrs,MTT法检测细胞活力显示,在1 mM6 mM Glu范围内,细胞存活率随药物浓度增加而逐渐降低,呈剂量依赖性关系。2)1 mM、2 mM、4 mM Glu处理PC12细胞24 hrs,细胞LDH释放增加。3)2 mM Glu处理4 hrs,MMP明显降低。4)2mM Glu处理4 hrs,细胞内ROS水平明显增加。5)Glu处理4 hrs,可使PC12细胞NOS活性增加,1 mM Glu组NOS活性提高了0.6倍,2 mM Glu组NOS活性提高了1倍,4 mM Glu组NOS活性没有继续升高。6)Glu作用4 hrs,可使PC12细胞NO生成量增加,1 mM Glu组NO生成量增加0.7倍,2 mM Glu组NO生成量增加2倍,4 mM Glu组NO生成量不再继续增加。2. ADMA抗Glu兴奋性毒性的作用及其机制1)ADMA（20320μM）对PC12细胞无明显的毒性作用。2)不同浓度Glu处理PC12细胞前30 mins,分别给予20μM、40μM ADMA预处理可以对抗1 mM、2 mM和4 mM Glu引起的细胞存活率降低。3)20μM ADMA预处理可以抑制1、2和4 mM Glu引起的细胞LDH释放。4)20μM ADMA预处理可改善2 mM Glu引起的MMP降低。5)20μM ADMA预处理可减少2 mM Glu诱导的ROS堆积。6)20μM、40μM ADMA预处理可抑制2 mM Glu增加细胞NOS活性。7)20μM、40μM ADMA预处理可抑制2 mM Glu促进NO生成。【结论】ADMA对Glu兴奋性毒性损伤PC12细胞具有保护作用,其机制可能与其抑制NOS过度活化、减少NO生成,进而降低细胞内ROS水平,改善MMP有关。