Ⅰ.TIPE2在CHB患者PBMCs的表达及意义 Ⅱ.CPI-17影响VSMCs表型参与动脉粥样硬化形成

论文摘要

研究目的TIPE2 （TNFAIP8L-2,tumor necrosis factor-a induced protein-8-like 2,肿瘤坏死因子α诱导蛋白8型-2）,是于2008年发现的新型抗炎蛋白,它能够负性调控固有免疫和适应性免疫,选择性表达于淋巴组织和炎症组织,可以阻止超敏反应的发生,维持机体内环境稳定。乙型病毒性肝炎是严重危害人类生命健康的世界性疾病,虽然目前大多数学者一致认为,由细胞免疫介导的免疫病理损伤是导致肝脏炎症的主要原因,但其确切的发生机制尚不明确。为此,本课题的主要目的是通过检测慢性乙型病毒性肝炎患者外周血单个核细胞TIPE2的表达情况,探讨TIPE2是否参与了慢性乙型病毒性肝炎的病程进展,为进一步研究TIPE2是否调控慢乙肝的发生机制奠定基础。研究方法1.病例收集收集慢乙肝患者肝素抗凝静脉血共51例,来自济南市传染病医院及山东省立医院感染科,诊断按2000年病毒性肝炎防治方案。健康志愿者组21人。2.检测慢乙肝患者外周血单个核细胞的TIPE2表达2.1慢乙肝患者外周血单个核细胞的分离收集慢乙肝患者、健康志愿者新鲜外周肝素抗凝血,利用人淋巴细胞分离液采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。2.2外周血单个核细胞总RNA的抽提及cDNA的制备Tizol法抽提外周血单个核细胞总RNA,紫外分光光度计测定RNA纯度及浓度,波长260／280 nm处的吸光度值（A）为1.8～2.0时用于实验,并统一定量为2.0μg。利用反转录试剂盒进行反转录制备cDNA。2.3实时荧光定量PCR方法检测TIPE2的mRNA水平根据PubMed中人TIPE2基因序列,利用Primer Premier5.0软件,设计扩增TIPE2片段的特异性引物,实时荧光定量PCR方法从RNA水平上检测TIPE2表达。2.4慢乙肝患者治疗前后TIPE2的mRNA水平的比较对同一病例治疗前后的慢乙肝患者的外周血单个核细胞TIPE2的表达情况进行比较分析。3.慢乙肝患者外周血单个核细胞TIPE2的表达与乙肝临床参数的相关性分析利用Prism GraphPad软件对慢乙肝患者外周血单个核细胞上TIPE2的mRNA水平与乙肝临床参数——血清ALT水平,AST水平,Tbil水平,HBV-DNA载量等的相关性进行分析。研究结果1. TIPE2在慢乙肝患者外周血单个核细胞上表达降低实时荧光定量PCR检测结果显示,TIPE2在慢乙肝患者外周血单个核细胞的表达水平显著低于健康志愿者对照（3.91±0.57 vs 6.9±1.2,P=0.0121）；对同一病例治疗前后外周血单个核细胞的检测结果显示,慢乙肝患者治疗后PBMCs的TIPE2 mRNA水平较治疗前显著升高。2. TIPE2的表达与乙肝临床参数的相关性分析临床病例,根据血清中的ALT水平,将慢性乙型肝炎患者分为ALT高水平组（ALT>47 IU/mL）和低水平组（ALT<47 IU/mL）,检测结果发现,TIPE2的mRNA水平在ALT低水平组病人外周血单个核细胞的表达显著高于高水平组（6.551±2.15 vs 3.409±0.477,P<0.05）,且与ALT水平呈负相关（r=-0.3269,P=0.0395）。同理,根据AST、Tbil、HBV-DNA水平,将慢性乙型肝炎患者分为AST高水平组（AST>47 IU/mL）和低水平组（AST<47 IU/mL）、Tbil高水平组（Tbil >0.5μmol/L）与低水平组（Tbil< 20.5μmol/L）和HBV-DNA高水平组（HBV-DNA>1000 copies/mL）与低水平组（HBV-DNA<1000 copies/mL）,TIPE2的mRNA水平在低水平组均显著高于高水平组（AST组,5.086±1.413 vs 2.595±0.3035,P=0.0276; Tbil组,4.497±0.7694 vs 2.474±0.3468,P=0.0219；HBV-DNA组,5.435±1.458 vs 3.132±0.3842,P=0.0398）。但是,统计学分析TIPE2 mRNA水平与AST、Tbil、HBV-DNA含量之间没有明显的相关性。结论1.TIPE2在慢乙肝患者外周血单个核细胞上的表达较正常人降低,同一患者治疗后表达水平显著升高；2. TIPE2的表达水平可能反映肝细胞的损伤程度：TIPE2的mRNA水平与反应肝细胞损伤程度的临床参数ALT水平呈负相关,但与AST、Tbil、HBV-DNA水平无明显的相关性。3.TIPE2可能通过影响机体的细胞免疫机制参与慢乙肝的病程进展。创新点1.首次研究了新型抗炎蛋白TIPE2与慢性乙型病毒性肝炎之间的可能关系；2.提出TIPE2可能通过影响机体的细胞免疫机制参与慢性乙型病毒性肝炎的发生与发展。TNFAIP8-2 （TIPE2）;研究目的CPI-17（PKC-potentiated protein phosphatase inhibitory protein-17）是17 kd的蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）抑制蛋白,主要表达于内脏和血管的平滑肌细胞,通过抑制肌球蛋白轻链磷酸化酶（myosin light chain phosphatase, MLCP）的主要酶活性调节单位——38 kDa的催化亚基蛋白磷酸酶1（Catalytic subunit of protein phosphatase 1, PP1c）,增强平滑肌收缩。血管平滑肌细胞在受到氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）.乏氧等刺激时,表型由收缩型转化为合成型,是动脉粥样硬化发生的关键步骤。本课题研究的主要目的是探讨CPI-17是否能够通过调控血管平滑肌细胞的表型转换进而影响动脉粥样硬化的形成。研究方法1.建立动脉粥样斑块小鼠模型取8至10周龄的载脂蛋白E基因敲除小鼠（ApoE-knockout小鼠）,无菌分离颈动脉,常规颈动脉套管后给予高脂饲养8周诱导动脉粥样斑块形成,断尾取血检测血清内脂蛋白水平,并取套管侧颈动脉OCT包埋后做冰冻切片,HE染色、油红O染色证实斑块形成。2.实时荧光定量PCR检测斑块组织的CPI-17及表型标志蛋白的mRNA水平2.1小鼠颈动脉总RNA的提取及cDNA的制备ApoE-knockout斑块模型小鼠麻醉后,生理盐水内灌注10分钟,取套管侧颈动脉,放入研钵内加入液氮研磨,加入Tizol试剂溶解提取总RNA,溶于RNase-free DNase水,除去基因组DNA污染.用2μg RNA,反转录试剂盒反转录获得cDNA.提取C57BL／6小鼠的颈动脉总RNA为对照。2.2实时荧光定量PCR方法检测CPI-17 mRNA水平以逆转录获得的cDNA为模版,加入CPI-17的特异性引物,实时荧光定量PCR方法检测ApoE-knockout小鼠斑块组织内的CPI-17 mRNA水平,与C57BL/6小鼠的颈动脉为对照,分析动脉粥样斑块形成时CPI-17的表达变化。2.3实时荧光定量PCR方法检测收缩型标志蛋白的mRNA水平以cDNA为模版,加入肌球蛋白重链（sm-MHC）、a-肌动蛋白（a-actin）的特异性引物,实时荧光定量PCR方法检测ApoE-knockout小鼠斑块组织内的平滑肌细胞收缩表型标志蛋白——肌球蛋白重链（sm-MHC）、a-肌动蛋白（a-actin）的mRNA水平,与C57BL／6小鼠的颈动脉为对照,分析动脉粥样斑块形成时血管平滑肌细胞的表型转换,并进行统计分析与CPI-17的相关性。3.体外研究ox-LDL、乏氧对血管平滑肌细胞表达CPI-17的影响3.1 ox-LDL对小鼠血管平滑肌MOVAS细胞表达CPI-17的影响以50μg/ml ox-LDL作用于体外培养的的小鼠平滑肌MOVAS细胞,分别于刺激后0 h、12 h、24 h和48 h,收集细胞洗涤后,提取细胞总RNA,反转录获得cDNA,采用实时荧光定量PCR方法检测并分析ox-LDL对血管平滑肌细胞表达CPI-17的影响。3.2乏氧培养对小鼠平滑肌MOVAS细胞表达CPI-17的影响将MOVAS细胞置于乏氧罐中培养,分别于培养后的0 h、12 h和24 h收集细胞,提取细胞总RNA,反转录获得cDNA,实时荧光定量PCR方法检测并分析血管平滑肌细胞在乏氧条件下CPI-17的表达变化。研究结果1.成功建立动脉粥样斑块模型ApoE-knockout小鼠常规颈动脉套管术后高脂饲养8周,根据血清内脂蛋白水平及套管侧颈动脉的HE、油红O染色结果显示动脉粥样硬化斑块模型构建成功。2. ApoE-knockout模型小鼠斑块组织的CPI-17及表型蛋白mRNA水平实时定量荧光PCR结果显示,ApoE-knockout小鼠套管侧颈动脉斑块组织的CPI-17 mRNA水平较C57BL／6小鼠颈动脉降低（90.09±27.40 vs 650.2±193.9,P=0.0004）；同时肌球蛋白重链（sm-MHC）、α-肌动蛋白（a-actin）的mRNA水平亦降低（sm-MHC:24.82±14.19 vs 124.9±35.48,P=0.0074；α-actin: 1065±442.6 vs 16740±8467,P=0.0092）3.ox-LDL.乏氧能够降低血管平滑肌细胞的CPI-17的表达实时荧光定量PCR结果显示,ox-LDL刺激组与乏氧刺激组CPI-17 mRNA水平较其相应的对照组均是降低的。其结果分别为：ox-LDL刺激,12h组vs 0 h组：0.7869±0.04393 vs 3.964±0.3973,P=0.0014;24 h组vs 0 h组：1.694±0.1290vs 3.666±0.2073,P=0.0013;48 h组vs 0 h组：1.590±0.09089 vs 3.501±0.2341,P=0.0016。乏氧刺激,24 h组vs 0 h组：10.62±0.1291 vs 17.03±0.7485, P=0.0011；48 h组vs 0 h组：0.9946±0.006504 vs 1.193±0.05135,P=0.0187。结论1.ApoE-knockout小鼠套管侧颈动脉斑块组织的CPI-17表达水平较野生型C57BL／6降低；2.模型小鼠粥样斑块组织的平滑肌细胞收缩型标志蛋白sm-MHC.α-actin的表达水平较正常颈动脉组织的表达水平下降,但与CPI-17的表达没有明显相关性；3.ox-LDL刺激及乏氧培养均可使小鼠的血管平滑肌MOVAS细胞表达CPI-17水平降低；4.CPI-17可能通过调控血管平滑肌细胞的表型转换影响动脉粥样硬化的发生发展。创新点：1.首次以ApoE-knockout小鼠诱导动脉粥样斑块模型研究了CPI-17在斑块组织内表达的变化；2.提出CPI-17可能通过调控血管平滑肌细胞的表型转换影响动脉粥样硬化的发生发展的新论点。

论文目录

第一部分

中文摘要

英文摘要

符号说明

论文正文

前言

材料与方法

技术路线

结果

讨论

小结

附图

参考文献

第二部分