鹅细小病毒VP3基因与鹅白细胞介素-2基因分泌性融合表达载体的构建及在乳酸杆菌中表达的研究

论文摘要

随着养殖业向集约化和管理向人性化发展，口服疫苗逐渐成为研究的热点和重点，乳酸杆菌是肠道正常的益生菌，具有天然的抗菌、抗病毒和抗肿瘤的作用。利用基因工程手段，将乳酸杆菌开发成为具有特定功能的基因工程菌，使其在肠道分泌抗原蛋白以达到免疫的目的。本研究以较为保守的鹅细小病毒（Goose Parvovirus，GPV）VP3基因为抗原基因，同时为了更好地提高免疫效果，将鹅白细胞介素-2（Intedeukin-2，IL-2）成熟蛋白基因IL2c与VP3基因融合，并使其在乳酸杆菌中得到良好表达，为研制鹅IL-2增强鹅细小病毒VP3乳酸杆菌口服基因工程疫苗准备了材料。1．为了探索乳酸杆菌在鹅养殖业中的应用，首先本研究对鹅肠道乳酸杆菌进行了调查，结果表明雏鹅在20日龄时肠道的乳酸杆菌已达到较高的水平，最高可达108CFU／g。分离鉴定了15株乳酸杆菌，分别属于旧金山乳杆菌、发酵乳杆菌、弯曲乳杆菌、类高加索乳杆菌、瑞士乳杆菌、双发酵乳杆菌、小鼠乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌和棒状乳杆菌棒状亚种。通过耐酸和耐胆盐试验表明L2和L8两株乳酸杆菌具有较强的耐受性，质粒检测均没有发现有质粒存在。2．根据GenBank上注册的短小乳酸杆菌（L．brevis）S-层蛋白基因序列设计一对引物，采用PCR法获得了S-层蛋白信号肽基因，将其克隆到pMD18-T载体并测序。序列分析表明序列全长为352bp，其中编码信号肽部分的90bp的碱基与GenBank中Z14250的完全相同，生物信息学分析也表明这是一段信号肽基因，氨基酸序列分析也表明它具备信号肽的典型特征，结果表明本试验克隆得到了短小乳酸杆菌S-层蛋白信号肽基因。3．根据GenBank中的鹅细小病毒B株全基因序列，设计合成一对引物，应用PCR技术扩增了鹅细小病毒强毒CHv株的VP3基因片段，将扩增后的VP3基因重组到pUC57载体上，并对插入片段进行序列测定，将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV、MDPV、PPV和CPV等不同宿主来源的细小病毒的VP3进行生物信息学比较及分析。结果表明，我国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1605bp，编码534个氨基酸，与国内外10株GPV的VP3基因进行比较，核苷酸同源性为93.4％-99.8％，氨基酸同源性为96.5％～99.3％，变异较小，是GPV保持一个血清型的分子基础。与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6％和89.9％，而与其它种属的细小病毒同源性均在30％以下，表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远。生物信息学分析表明它是一种疏水性的、稳定的、有强抗原性的膜外蛋白，有3个潜在的糖基化位点。4．参照GenBank中发表的鸭IL-2基因保守序列，设计了一对引物，采用RT-PCR技术从ConA刺激的四川白鹅外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出了鹅IL-2基因，并进行了克隆和测序。结果显示鹅IL-2基因全长468bp，含有一个441bp的ORF区，编码146个氨基酸。生物学软件分析表明该序列编码的氨基酸序列中有4个磷酸化位点，1个糖基化位点，含有21个氨基酸残基组成的信号肽。同源性分析表明四川白鹅IL-2基因与浙江白鹅的同源性极高，核苷酸和氨基酸同源性分别为99.8％和100％，与鸭、鸡和火鸡IL-2核苷酸及氨基酸序列同源性分别为92.2％、77.5％、78.2％和85.8％、65.5％、64.1％，而与其它种属的哺乳动物及啮齿类动物（如人、猴、大鼠、牛、马、猪、猫、小鼠、兔和鹿）的IL-2基因的核苷酸和氨基酸同源性分别低于45％和28％，进化树分析也表明四川白鹅IL-2基因与鸭和鸡具有较近的亲源关系。成熟蛋白IL2c基因全长为407bp，含有一个378bp的编码区，编码126个氨基酸。5．首先通过酶切连接和PCR方法将SP基因与VP3基因连接，然后再利用酶切连接的方法通过在引物上加上一个由GSGGSGG 7个氨基酸组成的短肽将VP3基因与IL2c基因连接，从而构建成了VP3-IL2c的融合蛋白基因。将该融合基因连接到乳酸杆菌表达载体pMJ67中，获得了重组的分泌性表达载体pMJ-SP-VP3-IL2c，通过电转化方法，将其转化到乳酸杆菌L．casei，通过乳糖诱导，成功表达了融合蛋白，SDS-PAGE结果显示在约76kD处有一特异性条带，其分子量与融合蛋白基因所推导的蛋白质分子量相符。并对表达条件进行了优化，结果表明在诱导剂的浓度为0.5％，诱导剂加入时间为OD600=0.5，诱导时间为20h时，可得到最高表达量。用兔抗GPV阳性血清进行West-blotting试验表明该重组表达的融合蛋白对GPV具有较好的免疫原性。采用Sepharose 4B琼脂糖凝胶为填料对重组表达蛋白进行分子筛层析，得到了纯度较高的重组蛋白。采用MTT法测定IL2c蛋白的活性，试验结果表明表达后的VP3-IL2c融合蛋白的淋巴细胞增殖系数可达3.84，表明IL2c蛋白具有生物学活性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 第一部分 文献综述
• 第一章 乳酸杆菌表达系统的研究状况
• 1 乳酸杆菌表达载体的优点
• 2 乳酸杆菌质粒
• 3 乳酸杆菌质粒的选择性标记
• 4 乳酸杆菌基因工程菌的应用
• 5 面临的挑战
• 第二章 鹅细小病毒结构蛋白的研究现状
• 1 结构蛋白的分子生物学特征
• 2 结构蛋白的体外表达
• 第三章 融合蛋白表达技术研究进展
• 1 融合蛋白的构建方式
• 1.1 自我融合
• 1.2 C端或N端融合
• 1.3 双亲和融合
• 1.4 信号肽与目的蛋白的融合
• 1.5 分泌-亲和融合
• 1.6 分泌-粘附融合
• 2 融合蛋白的连接
• 2.1 直接相连
• 2.2 稀有碱基相连
• 2.3 柔性肽相连
• 第二部分 实验研究
• 第四章 鹅肠乳酸杆菌的调查、分离鉴定及筛选
• 1 材料
• 1.1 鹅粪便
• 1.2 菌种
• 1.3 试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 正常鹅肠道乳酸杆菌调查
• 2.2 样品的采集
• 2.3 乳酸杆菌的分离
• 2.4 乳酸杆菌的纯化
• 2.5 乳酸杆菌的鉴定
• 2.6 耐酸性试验
• 2.7 耐胆盐试验
• 2.8 乳酸杆菌质粒检测
• 3 结果
• 3.1 鹅肠道乳酸杆菌调查结果
• 3.2 乳酸杆菌鉴定结果
• 3.3 乳酸杆菌耐酸性试验结果
• 3.4 乳酸杆菌耐胆盐试验结果
• 3.5 质粒检测结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第五章 乳酸杆菌S-层蛋白信号肽基因的克隆及序列测定
• 1 材料
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 配制试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 L.brevis基因组DNA的提取
• 2.3 PCR扩增L.brevis S-层信号肽（SP0）
• 2.4 SP0基因的纯化
• 2.5 JM109感受态细胞的制备
• 2.6 纯化的SP0基因与pMD18-T的连接
• 2.7 转化感受态细胞
• 2.8 质粒的提取
• 2.9 重组质粒的酶切鉴定
• 2.10 SP0基因序列测定及分析
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增
• 3.2 重组质粒的酶切鉴定
• 3.3 SP0测序结果
• 3.4 生物信息学分析结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第六章 鹅细小病毒VP3基因的克隆、测序及分子特性分析
• 1 材料
• 1.1 病毒
• 1.2 载体
• 1.3 鹅胚
• 1.4 试剂
• 1.5 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 病毒核酸的提取
• 2.3 VP3基因PCR扩增
• 2.4 PCR产物回收
• 2.5 纯化产物酶切
• 2.6 回收
• 2.7 连接
• 2.8 转化
• 2.9 质粒的提取
• 2.10 重组质粒的PCR鉴定及酶切鉴定
• 2.11 VP3基因序列测定
• 2.12 VP3序列及推导蛋白质的生物信息学分析
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增
• 3.2 重组质粒的筛选及鉴定
• 3.3 VP3编码基因的序列测定及同源性比较
• 3.4 VP3基因推导氨基酸同源性比较
• 3.5 系统进化树分析
• 3.6 疏水性分析结果
• 3.7 抗原性分析结果
• 3.8 跨膜区预测结果
• 3.9 磷酸化位点预测结果
• 3.10 N-糖基化位点预测结果
• 3.11 二级结构预测结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第七章 鹅白细胞介素-2基因及其成熟蛋白基因IL-2c的克隆、测序及生物信息学分析
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 酶及试剂
• 2 方法
• 2.1 IL-2基因的克隆
• 2.2 IL-2成熟蛋白基因（IL2c）的克隆
• 3 结果
• 3.1 RT-PCR结果
• 3.2 四川白鹅IL-2基因的酶切鉴定结果
• 3.3 IL-2序列测定结果
• 3.4 IL-2基因同源性比较及遗传进化树分析
• 3.5 IL-2信号肽预测
• 3.6 IL-2成熟蛋白基因PCR结果
• 3.7 pUC-IL2c酶切鉴定结果
• 3.8 IL2c序列测定结果
• 3.9 IL2c疏水性分析
• 3.10 IL2c抗原性分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 第八章 鹅细小病毒结构蛋白VP3基因与鹅IL2c基因分泌性融合表达载体的构建
• 1 材料
• 1.1 菌株及质粒
• 1.2 酶及试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 SPO基因和VP3基因的连接
• 2.2 SP+VP3基因的获取
• 2.3 SP-VP3基因与IL-2c融合基因的构建
• 2.4 分泌性表达载体的构建
• 3 结果
• 3.1 SP0与VP3连接
• 3.2 SP-VP3基因PCR
• 3.3 重组质粒酶切鉴定
• 3.4 SP-VP3基因的序列测定
• 3.5 pUC-SP-VP3-IL2c重组质粒酶切鉴定
• 3.6 重组表达载体的PCR鉴定
• 3.7 重组表达载体的酶切鉴定
• 4 讨论
• 4.1 构建策略
• 4.2 关于酶切位点的选择
• 4.3 关于表达载体的选择
• 4.4 关于融合蛋白的选择
• 5 小结
• 第九章 融合表达载体在乳酸杆菌中的分泌表达及其活性检测
• 1 材料
• 1.1 菌株及表达质粒
• 1.2 酶及试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 乳酸杆菌感受态细胞的制备
• 2.2 电转化
• 2.3 阳性菌株的筛选及鉴定
• 2.4 融合蛋白在乳酸杆菌中的表达
• 2.5 表达产物的转印
• 2.6 表达产物的免疫印迹
• 2.7 重组蛋白的纯化
• 2.8 MTT法检测IL-2的活性
• 3 结果
• 3.1 重组阳性乳酸杆菌的PCR鉴定
• 3.2 表达产物SDS-PAGE分析
• 3.3 表达条件的优化
• 3.4 重组蛋白的相对表达量
• 3.5 表达产物Western-blotting分析
• 3.6 重组蛋白过柱纯化效果
• 3.7 表达产物IL2c蛋白活性分析
• 4 讨论
• 4.1 关于电转化
• 4.2 诱导表达
• 4.3 表达条件的优化
• 4.4 Western-blotting检测
• 4.5 MTT法检测IL2c蛋白活性
• 5 小结
• 第三部分 结论
• 第四部分 参考文献
• 第五部分 附件材料
• 附录一 主要溶液的配制
• 附录二 测序图谱
• 1 pMD-SP0基因测序结果
• 2 pUC57-VP3基因测序结果
• 3 pMD-IL2基因测序结果
• 4 pUC-IL2c基因测序结果
• 5 pMD-SP-VP3基因测序结果
• 致谢
• 作者简介
• 后记