猪圆环病毒免疫组织化学诊断体系的构建

论文摘要

本实验通过将质粒PGEX-ORF2转化大肠埃氏菌BL21（DE3）的方法,经IPTG诱导,成功表达了重组猪圆环病毒Ⅱ型ORF2（PCV-ORF2）的融合蛋白。通过对以包涵体形式表达的融合蛋白进行复性、透析得到重组融合蛋白,并以此为抗原免疫家兔,制备兔抗PCV-ORF2的IgG抗体,再以此IgG为第一抗体,选择最佳工作浓度,采用免疫组织化学Envision二步法,对肺组织中的病毒抗原进行定位、定性和定量检测,确立了诊断标准,构建了PCV2的Envision法诊断体系。试验采用RT-PCR诊断方法作为印证,并与间接ELISA诊断方法进行对比。试验结果证明,本试验制备的兔抗PCV-ORF2纯度高,特异性强,效价可达到1:10240(210)。肺组织阳性表达主要出现在肺巨噬细胞、肺泡上皮细胞和支气管粘膜上皮细胞的胞浆内。本研究构建的免疫组织化学诊断体系,不但可以对PCV2进行实验室鉴别诊断,也能广泛应用于基层兽医单位,及时明确诊断抗原,提高临床确诊率,更快速有效地防制该病、减少经济损失。同时本研究成果也将为其他多种畜禽病毒性疾病的诊断提供新的思路和手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述 猪圆环病毒的研究进展
• 1 病原学
• 1.1 病毒的发现
• 1.2 病毒的理化性质
• 1.3 PCV的分子生物学特性
• 2 猪圆环病毒2型流行特点
• 3 临床症状与病理变化
• 3.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）
• 3.2 猪皮炎/肾病综合征（PDNS）
• 4 诊断技术
• 4.1 病毒的分离与鉴定
• 4.2 抗体检测
• 4.3 抗原的检测
• 第二部分 本试验研究的内容、目的和意义
• 第三部分 试验研究内容
• 试验一 兔抗猪圆环病毒Ⅱ型ORF2重组蛋白抗体的研制
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试验所需部分试剂制备和配制
• 1.3 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 重组细菌的诱导表达
• 2.2 重组蛋白包涵体的提取
• 2.3 免疫与抗血清的制备与纯化
• 2.4 PCV-ORF2抗血清效价的检测
• 2.5 SDS-PAGE电泳法检测ORF2融合蛋白纯度
• 2.6 Western blotting法检测抗血清特异性
• 3 结果
• 3.1 重组蛋白的表达及包涵体提取的结果
• 3.2 抗体效价的检测结果
• 3.3 抗血清特异性的检测结果
• 4 讨论
• 4.1 PCV-ORF2重组蛋白的应用
• 4.2 兔抗猪PCV-ORF2多克隆血清的纯化
• 5 结论
• 5.1 本实验成功诱导表达PCV-ORF2重组蛋白并提取出相应包涵体,该重组蛋白不仅具有较高的纯度而且具有很强的免疫原性
• 10)'>5.2 成功制备兔抗猪PCV2-ORF2血清,其抗体效价达到1:10240(2¹⁰)
• 5.3 成功纯化兔抗猪PCV2-ORF2多克隆血清,抗体纯度较高,特异性强
• 5.4 上述实验结果为进一步构建免疫组织化学诊断体系完成了前期工作
• 试验二 免疫组化检测猪圆环病毒及临床诊断标准的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 猪圆环病Ⅱ型的临床及病理变化
• 2.2 H.E染色结果
• 2.3 免疫组织化学检测结果
• 2.4 间接ELISA试验结果
• 3 讨论
• 3.1 兔抗猪圆环病毒特异性抗体的选择和制备
• 3.2 免疫组织化学Envision法的选择
• 3.3 免疫组织化学诊断标准的确立
• 3.4 免疫组织化学检测方法与间接ELISA检测方法的比较
• 3.5 免疫组织化学操作中易出现的问题
• 3.6 免疫组织化学方法质量的控制
• 4 结论
• 4.1 Envision法可以对PCV2进行定性、定量和定位诊断,准确率高,特异性强
• 4.2 肺脏为Envision法检测PCV2的靶组织,肺巨噬细胞为主要阳性细胞
• 4.3 本试验初步建立了采用免疫组织化学技术临床诊断PCV2的标准,为PCV2的实验室鉴别诊断和临床诊断提供了有效的检测手段
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读硕士期间发表及待发表的论文