A型流感病毒16种HA血清型DNA微阵列检测方法研究

论文摘要

流感是巾流感病毒引起的具有高度传染性的呼吸系统疾病，流感病毒属于正黏病毒科，可分为A型，B型，C型。其中A型和B型流感病毒引起的季节性流感，发病率与死亡率高，造成的经济损失巨大，不断引发全球性健康问题。A型流感病毒报据病毒表面蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性，可分为17个HA和10个NA亚型，这些亚型的病毒组合几乎都可以从水生鸟类、家禽和其它禽类中分离到。A型流感病毒包含8个基因片段，至少编码14种以上的病毒蛋白。造成大流行的流感病毒常常是由两种毐株的不同RNA节段在感染细胞吋发生基因重排而产生的。流感病毒在理论上可以重组出现256（28）种不同基因型。为应对流感流行，己出现了多种快速、灵敏、准确的分子生物学检测技术。II前对流感核酸样品的检测，大多数是基于聚合酶链反应（PCR）、DNA测序及寡核苷酸微阵列等三种技术。测序可以提供详细的序列，大范围的基因背景信息，也可检测出未知微生物，但这种方法费时，需昂贵设备，仍需人工去除其无关的背景DNA序列；RT-PCR/PCR检测技术是一种非常快速和灵敏的检测方法，但在检测多种微生物或对多种亚型进行分型时，仍受通量限制；而DNA微阵列技术恰好弥补了PCR及DNA测序技术的不足，且有良好的敏感性和特异性，还可实现高通蛍。本研究计对当前A型流感病毒亚型多，高通量分型难等问题，应用低密度DNA微阵列分析技术，建立了流感病毒16种HA血清型鉴定方法。在NCBI流感病毒资源库中挑选出各亚型A型流感病毒代表序列，通过生物信息学方法分析16种亚型血凝素之间的同源关系，根据亚型间、亚型内的同源关系，确定探针的最佳长度，获得了每个亚型同--基因位点出现最多频率的…致序列，设计了18对PCR引物及108条用于分型鉴定的特异性寡核苷酸探针，实验筛选优选出54条探针。在此基础上，将18对PCR引物设计分为4组，建立分组多重PCR方法，扩增及标记靶基因。通过体外转录方法制备16种HA基因的病毒RNA,梯度稀释，进行敏感性试验。经数据分析，最终确定当相应有…条探针SNR532為2或信号强度F532Mean-B532^2000时判定为阳性，得出本研究的最低检测下限在100-1000个RNA拷贝，并具有很好的重复性。为验证DNA微阵列方法对新亚型流感病毒的检测性能，应用反向遗传操作技术拯救了重配H1N1、H4N6、H8N4、H9N1亚型流感病毒，并对其进行检测，结果表明，建立的检测方法可确定HI、H4、H8、H9等亚型反向遗传重配流感病毒株。应用本研究室自有毒株对DNA微阵列检测方法进行了敏感性、特异性试验，可特异性检测H1N1、H3N2、H9N2、H5N1亚型等18种毒株，最低检测下限为1X103EID5Q病毒滴度。幵展了流感分型DNA微阵列应急检测研究，成功回顾性检测了2004年吉林省白城市H5N1亚型高致性禽流感病毒阳性临床样品，并对2009年甲型H1N1流感病毒、季节性H1N1流感病毒和2013年H7N9亚型禽流感病毒进行区分鉴定，结果表明，研制的流感分型芯片可快速、特异并高通量筛查出不同亚型流感病毒，II在流感病毒应急防控中发挥了积极作用。上述建立的DNA微阵列检测方法，能够准确进行A型、B型流感病毒及H1-16种亚型的分型检测，实现了检测流感病毒分型及亚型的高通量、高特异性，简化了复杂病原的操作程序，显著缩短了吋间，为流感快速检测、监测和应急处置提供了一个快速、方便、准确的分子生物学诊断技术。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 绪论
• 第一篇 文献综述
• 第1章 流感病毒分子诊断技术研究进展
• 1 流感病毒
• 2 胶体金快速免疫层析法
• 3 RNA检测系统的样品制备
• 4 PCR检测法
• 5 等温条件下的DNA扩增
• 6 DNA微阵列
• 7. 结语
• 第2章 DNA微阵列检测技术研究进展
• 第二篇 研究内容
• 第1章 流感病毒序列的生物信息学分析及探针设计研究
• 1 材料
• 1.1 目的基因与序列
• 1.2 生物信息学分析软件
• 2 方法
• 2.1 目的基因与序列的选取
• 2.2 同源性比对及一致序列获取
• 2.3 PCR引物设计
• 2.4 探针设计及筛选
• 3 结果
• 3.1 目的基因序列的选取
• 3.2 同源性比对一致序列获取
• 3.3 多重PCR引物设计
• 3.4 探针设计及筛选
• 4 讨论
• 5 小结
• 第2章 流感病毒分型探针的筛选验证研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第3章 流感病毒DNA微阵列分型方法的建立研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第4章 DNA微阵列方法鉴定反向遗传重配流感病毒研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第5章 流感分型DNA微阵列应急检测研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果
• 导师及作者简介
• 致谢