龟鹿二仙胶及其拆方对体外培养大鼠关节软骨细胞凋亡的影响

论文摘要

目的：应用大鼠关节软骨细胞体外培养技术,观察龟鹿二仙胶及其拆方的含药血清对软骨细胞增殖的影响,筛选其最佳剂量含药血清；对比、分析复方及各拆方的药效差别,探寻复方的配伍机理；从细胞及基因水平研究在硝普钠（SNP）诱导下复方及拆方含药血清对软骨细胞凋亡的影响,探讨其抑制软骨细胞凋亡、减少细胞凋亡率,改善并调节软骨细胞增殖与凋亡的平衡机理。方法：1.龟鹿二仙胶及其拆方药液的煎制及含药血清的制备；2.大鼠软骨细胞体外培养体系的建立；3.MTT法观察龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对软骨细胞增殖的药效差别,筛选各药物组含药血清的最佳干预剂量；流式细胞仪测定SNP诱导后软骨细胞的凋亡率,筛选最适宜的诱导浓度；4.免疫细胞化法观察龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对SNP诱导后软骨细胞Bax、bcl-2表达的影响；5.荧光定量PCR观察龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对SNP诱导后软骨细胞Bax、bcl-2表达的影响。结果：1.成功培养4周龄SD大鼠关节表面软骨细胞。原代细胞培养后,与甲苯胺蓝染色呈异染,说明培养的是软骨细胞,鉴定成功；2.龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对SD大鼠软骨细胞增殖的影响显示：龟鹿二仙胶及其拆方含药血清均能促进软骨细胞增殖且无递增效应,其中各药物组中剂量含药血清促进软骨细胞增殖的作用最佳且48h时药效最强；各组中剂量含药血清48h时比较：龟鹿二仙胶组及OTL组与生理盐水对照组比较有显著差异（P<0.01）；龟鹿二仙胶组、OTL组与龟板、鹿角、人参、枸杞比较有显著差异（P<0.05）；龟板、鹿角与人参、枸杞比较有统计学意义（P<0.05）。流式细胞仪测定SNP诱导后软骨细胞的凋亡率结果显示：1mmol/L的SNP对软骨细胞增殖的抑制作用最适宜。3.免疫细胞化染色结果显示：经SNP诱导后,各组标本均可见凋亡基因Bax、bcl-2表达，bcl-2表达部位为胞浆,可见棕黄色颗粒状或片状阳性染色,Bax表达部位为胞核及胞浆,可见棕黄色片状或颗粒状阳性染色,阴性对照未见异常染色；龟鹿二仙胶干预组与生理盐水对照干预组比较有显著差异（P<0.01）；龟鹿二仙胶、OTL干预组与各拆方干预组比较有统计学意义（P<0.05）；龟板、鹿角干预组与人参、枸杞干预组比较有统计学意义（P<0.05）。4.荧光定量PCR结果显示：各药物组和对照组在荧光定量PCR过程中,Bax、bcl-2基因的荧光信号在进入指数期时,荧光信号被检测到且呈指数增长,各药物组Bax、bcl-2的溶解曲线均为单一峰,表明定量准确,得出的表达量值可信；各药物组数值在Bax表达中与生理盐水干预对照组成反比,在bcl-2表达中与生理盐水干预对照组成正比；龟鹿二仙胶干预组、OTL组Bax、bcl-2的表达量与其拆方组比较有统计学意义（P<0.05）；龟板、鹿角组与人参、枸杞组比较有显著差异（P<0.05）。结论：龟鹿二仙胶及其拆方可明显促进体外培养大鼠关节软骨细胞增殖且无递增效应；复方及各拆方中剂量含药血清48h时药效最佳,复方药效优于各拆方,总体药效比较为：龟鹿二仙胶>龟板》鹿角>人参>枸杞；在复方中发挥主导作的是龟板与鹿角,可作为今后研究的重点；人参药效不及龟板、鹿角,提示人参只有在病损状态下才能完全发挥补虚、补气的效果；枸杞只是在方中发挥协同作用来增强复方疗效,今后可调整用量或删除配伍；龟鹿二仙胶及其拆方含药血清均可抑制由SNP诱导的经NO途径进行的软骨细胞凋亡,这种过程可能与对抗经NO抑制软骨细胞内线粒体及柠檬酸循环有关的酶有关；可在翻译水平对SNP诱导后的软骨细胞bcl-2与Bax的表达具有良好维持作用,这种作用主要体现在凋亡早期通过下调Bax基因的表达量来抑制软骨细胞的凋亡。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 1. 实验材料
• 1.1 主要仪器和设备
• 1.2 主要试剂
• 1.3 实验材料
• 2. 实验方法
• 2.1 龟鹿二仙胶及其拆方药液的煎制及含药血清的制备
• 2.2 大鼠软骨细胞体外培养体系的建立
• 2.3 MTT法筛选各药物组最佳干预剂量血清及软骨细胞凋亡模型的建立
• 2.4 免疫组化法检测各组最佳干预剂量含药血清干预后软骨细胞bcl-2、Bax的表达
• 2.5 荧光定量PCR检测各组最佳剂量含药血清干预后软骨细胞bcl-2、Bax的表达
• 2.6 统计学分析
• 实验结果
• 1 软骨细胞体外培养的形态学观察及鉴定
• 2 MTT法筛选各药物组最佳干预剂量含药血清
• 3 流式细胞仪检测SNP诱导后软骨细胞的凋亡率
• 4 SNP诱导软骨细胞凋亡药物干预后免疫细胞化染色结果
• 5 SNP诱导软骨细胞凋亡药物干预后荧光定量PCR结果
• 讨论
• 1 龟鹿二仙胶的配伍特点及拆方研究的意义
• 2 中药含药血清产生的意义及血清制备中存在的问题
• 3 体外软骨细胞的培养
• 4 最佳干预剂量含药血清及诱导剂浓度的选择
• 5 龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对大鼠软骨细胞凋亡的影响
• 6 本课题研究在临床上的指导意义
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献
• 作者简历