G1和M期体细胞核在核移植后形态重建模式研究

论文摘要

自从世界上第一例体细胞核移植动物“Dolly”绵羊出生后,核移植已经在多个物种取得成功,并且也得到了很多基因修饰的体细胞核移植动物。但不论那个物种,体细胞核移植的成功率都很低。有很多因素影响体细胞核移植的效率,其中受体胞质的质量和核移植时体细胞的周期就是两个重要因素。本实验研究了亮甲酚兰（Brilliant cresyl blue, BCB）染色对猪卵母细胞的筛选效果。在GV期对猪卵母细胞进行BCB染色后,分别检查了着色组（BCB+）、未着色组（BCB-）、和对照组卵母细胞的成熟率、激活后孤雌胚胎的早期发育能力和作为胞质受体支持核移植胚胎早期发育的能力。本实验还比较了G1早期与M期猪成纤维细胞核移植胚胎第一次卵裂前核形态学的变化及在体外的早期发育能力,观察了G1早期成纤维细胞核融合进入去核卵母细胞（eG1-NT胚胎）后2、4、6h的形态学事件;观察了M期成纤维细胞核融合进入去核卵母细胞（M-NT胚胎）后2、4、6、19、24h的形态学事件,并对两种核移植胚胎第一细胞周期内的形态学变化模式进行了比较。同时也比较了eG1-NT胚胎与M-NT胚胎在体外发育到囊胚的能力。取得如下结果:BCB+组卵母细胞发育到MII期的比率（91.6%）显著高于（P<0.05）BCB-（64.0%）和对照组卵母细胞（77.5%）;BCB+组孤雌胚胎的囊胚率（34.9%）显著高于（P<0.05）BCB-组（9.5%）和对照组（23.1%）;BCB+组核移植胚胎的囊胚率（23.0%）显著高于（P<0.05）BCB-组（5.0%）和对照组（14.1%）。在融合后2hM-NT胚胎与eG1-NT胚胎核有一半左右（50.0%和44.8%）处于膨大状态;M-NT胚胎在融合后4h形成类原核的比例（77.8%）显著高于融合后4h时eG1-NT胚胎形成类原核的比例（55.3%）（P<0.05）。融合后6h绝大多数（89.3%和75.0%）M-NT胚胎与eG1-NT胚胎核形成了类原核。M-NT胚胎在融合后19h有77.4%具有两个核,并且在融合后19h和24h观察时都没有发现排类极体（PBCs）的现象。M-NT胚胎胚与eG1-NT胚胎在体外培养时,发育到囊胚的能力没有显著差异（P>0.05）。以上结果表明BCB染色是一种有效筛选高质量猪卵母细胞的方法;M-NT胚胎比eG1-NT胚胎更早的形成类原核,二者在体外早期发育能力相似。但由于用融合法得到M-NT胚胎不能排出类极体,很可能会形成四倍体胚胎。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 体细胞核移植（克隆）研究的历史概况
• 1.2 体细胞核移植相关机理研究现状
• 1.2.1 受体胞质的选择
• 1.2.2 供核体细胞与受体卵母细胞的细胞周期协调
• 1.2.3 体细胞核移植的效率
• 1.3 哺乳动物体细胞核移植基本程序
• 1.3.1 供核体细胞的准备
• 1.3.2 卵母细胞的培养
• 1.3.3 重构胚的构建和激活
• 1.4 体细胞核移植技术的应用价值
• 1.4.1 体细胞克隆技术在畜牧业生产中的应用
• 1.4.2 体细胞克隆技术对转基因动物生产的影响
• 1.4.3 体细胞克隆技术在临床上的潜在应用方向
• 1.4.4 体细胞克隆技术在动物保护方面的应用价值
• 1.4.5 体细胞核移植技术在医药生产方面的价值
• 1.4.6 体细胞核移植对帮助阐明一些生物学基础问题的价值
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 猪卵巢与猪胎儿
• 2.1.2 试剂盒与试剂
• 2.1.3 主要器材
• 2.1.4 缓冲液及主要试剂的配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 卵母细胞的采集
• 2.2.2 亮甲酚兰（BCB）染色
• 2.2.3 卵母细胞体外成熟培养
• 2.2.4 供核体细胞的准备
• 2.2.5 体细胞核移植
• 2.2.6 胚胎培养及发育的观察
• 2.2.7 体细胞核移植后重构胚核形态的观察及去核率的检测
• 2.2.8 统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 BCB 染色筛选优质猪卵母细胞
• 3.1.1 BCB 染色对猪卵母细胞成熟的影响
• 3.1.2 BCB 染色对猪卵母细胞孤雌发育的影响
• 3.1.3 BCB 染色对猪核移植胚胎发育的影响
• 3.2 不同周期体细胞核移植重构胚早期发育的比较
• 3.2.1 2-甲氧乙醇（2ME）法筛选细胞的结果
• 3.2.2 去核率的检测
• 3.2.3 不同周期体细胞核移植胚胎早期核形态学事件
• 3.2.4 不同周期供体细胞对核移植胚胎发育的影响
• 4 讨论
• 4.1 BCB 筛选卵母细胞的作用
• 4.1.1 BCB 筛选与形态学筛选的关系
• 4.1.2 BCB 浓度的确定
• 4.1.3 BCB 染色对筛选高质量猪卵母细胞的效果
• 4.2 不同细胞周期供体核移植胚胎早期发育的比较
• 4.2.1 供体细胞周期的确定
• 4.2.2 细胞周期同步化方法
• 4.2.3 核移植胚胎第一次卵裂前核的形态学事件
• 4.2.4 供体细胞周期对核移植胚胎早期发育的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间发表的文章