番茄红素-β-环化酶反义基因对番茄的遗传转化

论文摘要

番茄红素不仅影响番茄果实的颜色,同时具有较强的抗氧化和防癌抗癌等作用。番茄是人们获得番茄红素的主要来源之一。目前的普通番茄品种番茄红素含量普遍不高,因此提高番茄果实中的番茄红素含量,对改善番茄品质,为农民增收和番茄加工企业提高经济效益具有重要价值。番茄红素的合成和降解及其相关酶和基因的深入研究使得对番茄中的番茄红素调控成为可能。本研究以普通番茄品种TTI1117A和灵光3号为材料,在优化番茄再生体系和遗传转化体系的基础上,通过农杆菌介导法将反义LYC-b基因导入番茄中,以抑制番茄红素降解、达到提高番茄中番茄红素含量的目的。主要研究结果如下:1.建立了番茄TTI1117A和灵光3号的高频再生体系探讨了18个6-BA与IAA不同浓度组合对番茄再生的影响,结果表明:2个番茄品种子叶和下胚轴诱导芽分化的最佳培养基为:MS+6-BA 2.0mg/L +IAA 0.1mg/L,诱导不定芽生根的最佳培养基为:MS + IAA 0.2mg/L。在芽分化最佳培养基上研究了基因型、外植体类型对番茄再生的影响,结果表明:不同基因型的同一种外植体分化率存在极显著差异,TTI1117A同一种外植体的分化率极限著高于灵光3号;同一基因型不同外植体的分化率存在极显著差异,子叶的分化率最高,下胚轴次之,子叶节最低。2.建立了农杆菌介导的番茄遗传转化体系在筛选出的诱导芽分化和诱导不定芽生根的最佳培养基上,分别研究了番茄子叶外植体和不定芽对卡那霉素的敏感性,结果表明:芽分化阶段Kan的筛选压力以60mg/L,不定芽生根阶段Kan的筛选压力以30mg/L为宜。抗性植株筛选方法:芽诱导阶段和不定芽生根阶段进行两次筛选。探讨了预培养时间、农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间、抑菌素浓度对番茄转化效率的影响,建立了番茄高效遗传转化体系:子叶外植体黑暗预培养48h,以MS液体培养基稀释的新鲜农杆菌（含Anti-LYC-b 5′+GUS /pBINPLUS植物表达载体）侵染外植体,侵染菌液浓度OD600=0.5,侵染时间10min,共培养时间为36h,浓度为500 mg/L的头孢霉素能很好的抑制农杆菌的生长,又能减少对外植体的伤害。3.获得了转基因番茄植株以子叶为转化受体,使用高效农杆菌介导遗传转化体系将反义LYC-b基因导入番茄,获得了9株TTI1117A抗性植株,26株灵光3号抗性植株,其中1株TTI1117A和4株灵光3号抗性株GUS检测呈阳性,阳性株率分别为11.1%,15.3%,PCR检测结果表明GUS检测阳性株均能扩增出397bp的目的条带,Nos.Ter引物对转基因番茄的PCR检测表明GUS检测阳性株均能扩增出192bp的条带,进一步证明反义Lyc-b5′基因已经整合到番茄基因组中,RT-PCR结果显示目的基因已经在RNA水平表达。4.对转基因番茄植株番茄红素含量进行了初步检测转基因植株叶片中的番茄红素和胡萝卜素含量测定表明,2个品种转基因植株叶片中的茄红素含量高于阴性对照,并达到显著水平,而且转基因植株叶片中的茄红素含量均高于胡萝卜素含量,阴性对照叶片中的胡萝卜素含量高于茄红素含量,表明LYC-b5′反义RNA已经表达并对番茄内源LYC-b的表达具有一定的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 番茄红素（Lycopene）研究进展
• 1.1.1 番茄红素性质及结构
• 1.1.2 番茄红素的生理功能
• 1.1.3 番茄红素的合成及提取
• 1.2 反义RNA 技术
• 1.2.1 反义RNA
• 1.2.2 反义RNA 的获得
• 1.2.3 反义RNA 技术的应用
• 1.3 番茄
• 1.3.1 番茄离体培养研究进展
• 1.3.2 番茄遗传转化研究进展
• 1.4 本研究的目的和意义
• 1.5 本试验研究的主要内容及预期目标
• 1.5.1 研究的主要内容
• 1.5.2 预期的目标
• 第二章 番茄高效离体再生体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同激素组合对番茄不定芽分化的影响
• 2.2.2 不同浓度生长素对不定芽生根的影响
• 2.2.3 基因型对番茄再生频率的影响
• 2.2.4 外植体类型对番茄再生频率的影响
• 2.3 结论与讨论
• 2.3.1 细胞分裂素和生长素对不定芽分化的影响
• 2.3.2 基因型及外植体类型对番茄再生的影响
• 2.3.3 生长素对不定芽生根的影响
• 2.3.4 畸形芽和盲芽
• 2.3.5 外植体褐变的原因及对策
• 第三章 番茄高效遗传转化体系的建立及反义LYC-b 对番茄的遗传转化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 农杆菌质粒的双酶切鉴定
• 3.2.2 番茄外植体卡那霉素筛选压的确定
• 3.2.3 预培养时间对番茄遗传转化的影响
• 3.2.4 农杆菌浓度对番茄遗传转化的影响
• 3.2.5 侵染时间对番茄遗传转化的影响
• 3.2.6 共培养时间对番茄遗传转化的影响
• 3.2.7 抑菌素浓度对番茄遗传转化的影响
• 3.3 讨论与结论
• 3.3.1 卡那霉素浓度的筛选
• 3.3.2 预培养时间对番茄遗传转化的影响
• 3.3.3 农杆菌浓度和侵染时间对番茄遗传转化的影响
• 3.3.4 共培养时间对番茄遗传转化的影响
• 3.3.5 抑菌素浓度对番茄遗传转化的影响
• 3.3.6 结论
• 第四章 番茄转基因植株的鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 抗性植株的GUS 检测
• 4.2.2 PCR 检测
• 4.2.3 RT-PCR
• 4.2.4 番茄叶片中番茄红素含量测定
• 4.3 讨论与结论
• 4.3.1 GUS检测
• 4.3.2 RNA 酶的污染问题
• 4.3.3 关于反义Lyc-b 基因对番茄的遗传转化
• 4.3.4 目的基因在转化植株中的遗传稳定性
• 第五章 结论与研究设想
• 5.1 建立了番茄TTI1117A 和灵光3 号的高频再生体系
• 5.2 优化了农杆菌介导的番茄遗传转化体系
• 5.3 获得了转基因番茄植株
• 5.4 转基因番茄植株叶片的番茄红素含量有所增加
• 5.5 关于进一步的研究设想
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 个人简介