奇异果甜蛋白thaumatin基因二价载体在玉米中的共表达及其在酵母中的表达

论文摘要

Thaumatin是一种超甜蛋白,来源于一种叫Thaumatococcus daniellii Benth的热带植物。其甜度按重量计是蔗糖的3000倍。其无毒、低热量、高甜度,是一种有可能取代蔗糖的新型甜味剂。但由于Thaumatococcus daniellii Benth生长条件苛刻,在原产地之外不能结实,这使得通过天然途径来提取Thaumatin变得不可能。因此人们便把希望寄托在Thaumatin的基因工程上。 迄今为止,人们已在几十种微生物、真菌中表达了Thaumatin,但表达产物不是没活性,就是产量偏低。考虑到Thaumatin来源于植物,具有植物偏爱的密码子,也许在植物中会表达得更好。于是人们又尝试在植物中表达Thauamtin。1990年,M.Witty用毛根转化技术（hairy root transformation technique）将甜味蛋白基因插入到马铃薯基因组中,得到的转基因植株均是甜味。该实验的意义在于使通过转基因技术来改良某些作物口味成为可能。然而,事实上,除了上述成功的报道外,目前为止,还没有其它有关thaumatin基因作为外源基因在高等植物中表达成功的例子。一般来说,外源thaumatin基因在受体植物中都能成功地转录,但却无法成功地转译。有试验表明,PDI（protein disulfide isomerase,蛋白二硫键异构酶）在蛋白折叠和分泌过程中起重要的作用,Moraleio把PDI基因和thaumatin基因在黑曲霉中进行共表达,就得到了单产为150mg/L的重组Thaumatin。 鉴于此,本实验室将thaumatin和PDI上游分别连上CaMV35S启动子,下游连上终止子,同时克隆于质粒pCAMBIA1302中,构建成二价协同表达载体pCAMBIA1302-TP,经测序证明了它们的正确性。将pCAMBIA1302-tha-PDI转入农杆菌LBA4404,侵染玉米18红新鲜幼胚及其诱导产生的胚性愈伤组织,拟通过组织培养技术得到玉米阳性植株。在玉米胚性愈伤组织状态最佳时进行侵染,摸索玉米幼胚诱导愈伤的一系列组培技术,培养活性状态良好的玉米胚性愈伤,但由于愈伤在侵染后分化条件的不成熟使本实验未能如期得到阳性植株,但此项实验仍有继续研究的必要性,探索甜味蛋白在玉米等高等植物中的表达及表

论文目录

• 目录
• 致谢
• 缩写符号说明
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 Thaumatin的发现历史及生化特性
• 1.2 Thaumatin的甜味机理
• 1.3 Thaumatin的生理功能
• 1.4 Thaumatin的基因工程
• 1.4.1 Thaumatin在原核生物中的表达
• 1.4.2 Thaumatin在真菌中的表达
• 1.4.3 Thaumatin在植物中的表达
• 1.5 研究意义
• 1.6 挑战与前景
• 2 本论文实验设计流程图
• 2.1 玉米篇
• 2.2 酵母篇
• 第一篇 奇异果甜蛋白thaumatin基因与蛋白二硫键异构酶PDI基因在玉米中的共表达
• 摘要
• Abstract
• 第一部分 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌种和质粒
• 1.1.3 酶和生化试剂
• 1.1.4 抗生素和生长激素
• 1.1.5 引物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 培养基的配制
• 1.2.2 thaumatin-PDI二价表达载体的构建
• 1.2.3 表达载体对农杆菌的转化
• 1.2.4 玉米胚性愈伤的获得
• 1.2.5 转基因玉米抗生素筛选浓度的确定
• 1.2.6 转基因玉米植株的获得
• 1.2.7 转基因玉米的分子检测
• 第二部分 结果与讨论
• 2.1 结果
• 2.1.1 植物表达载体pCAMBIA1302-TP的构建
• 2.1.2 将pCAMBIA1302-TP转入农杆菌中
• 2.1.3 玉米胚性愈伤组织的获得
• 2.1.4 转基因玉米抗生素筛选浓度的确定
• 2.1.5 玉米的转化及再生
• 2.2 讨论
• 第三部分 展望
• 第二篇 奇异果甜蛋白thaumatin基因在酵母中的表达
• 摘要
• Abstract
• 第一部分 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 酵母菌菌种及质粒
• 1.1.2 酶和生化试剂
• 1.1.3 抗生素
• 1.1.4 引物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 培养基的配制
• 1.2.2 表达载体pDBLeu-tha的构建
• 1.2.3 表达载体对酵母菌的转化
• 1.2.4 阳性转化子的PCR鉴定
• 1.2.5 酵母菌蛋白分析
• 第二部分 结果与讨论
• 2.1 结果
• 2.1.1 酵母表达载体的构建
• 2.1.2 阳性转化子的PCR检测
• 2.1.3 酵母菌的SDS-PAGE检测
• 2.2 讨论
• 第三部分 展望
• 参考文献
• 附录Ⅰ 化学药品的配制
• 附录Ⅱ 玉米表达载体及酵母表达载体测序图
• 附录Ⅲ 基因正义链全序列
• 附录Ⅳ 硕士期间发表或接收的论文及其他科研工作