论文摘要
目的角膜上皮层是覆盖角膜表面的复层上皮组织,对于维持眼表的健康和稳定具有重要作用。正常状态下,角膜上皮细胞可以不断的脱落、更新;外界因素引起的角膜上皮损伤也可很快修复。角膜上皮层的自我修复有赖于角膜缘基底层的成体干细胞——角膜缘干细胞（Limbal stem cells,LSCs）。当角膜缘受损,引起角膜缘干细胞缺乏或功能缺陷（Limbal stem cellscleficiency,LSCD）时,会发生持续性角膜上皮糜烂,角膜结膜上皮化,新生血管长入和假性翼状胬肉形成等一系列病理改变,给患者带来巨大的痛苦,甚至最终导致失明。随着对LSCs研究的深入和发展,相继出现了一系列针对上述疾病的治疗方法,包括:羊膜移植、自体角膜缘移植、异体角膜缘移植及培养LSCs移植等。但是对于严重的LSCD,特别是双眼LSCD,目前还没有十分有效的治疗方法,因此探讨应用其他干细胞系重建LSCs缺乏性眼表是目前亟待解决的问题。骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是来源于胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞,主要存在于骨髓,由于其高度的自我更新能力和多向分化潜能而受到广泛的关注。大量文献研究表明在适当条件下,MSCs不但可分化成骨、软骨、脂肪和肌肌肉等中胚层组织,还可以分化成脑、皮肤、视网膜等其他胚层的组织。这种跨系分化被称为转分化。研究证明MSCs可以分化为皮肤,肺及其他组织的上皮细胞,而近期研究发现将体外培养的人MSCs移植到损伤的兔或鼠角膜表面,可以重建损伤眼表,其治疗作用主要与抑制炎症反应和新生血管有关。这些研究结果提示MSCs在角膜组织损伤修复中具有潜在的重大应用价值。为检测MSCs是否可以分化为角膜上皮细胞,我们用含有兔MSCs的胶原膜重建兔损伤眼表,结果显示移植的兔MSCs到达角膜上皮基底层,并表达角膜上皮细胞的表面标记抗原细胞角蛋白3（cytokeratin 3）（已投稿）,说明MSCs具有向角膜上皮细胞分化的可能。但目前关于MSCs向角膜上皮细胞诱导分化的研究还十分有限;并且由于细胞融合现象的发现,人们对于MSCs多向分化的可塑性存在一定争议。因此进一步研究MSCs向角膜上皮细胞分化的可行性,及这一过程中可能的参与因素具有重要意义。为此本研究利用不同体外环境诱导培养MSCs,初步证明MSCs可以在体外诱导分化为角膜上皮样细胞,并且在这一分化过程中表皮生长因子（Epidermalgrowth factor,EGF）具有重要作用。本研究首次证明在体外诱导条件下MSCs可以分化为角膜上皮样细胞,为眼表疾病的细胞替代治疗提供了新的理论基础。方法1、无菌条件下取兔骨髓,用密度为1.073的percoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法（800g,30分钟）分离骨髓单核细胞层,DMEM培养基重悬细胞,以4.0×106/cm2的密度接种,37℃、体积分数5%CO2孵育箱内培养,正常换液、传代。当细胞达到60%～70%融合时,加入含有BrdU（浓度为10umol/L）的新鲜DMEM培养基培养24小时,以获得BrdU标记的兔MSCs。2、无菌条件下环形取1.5～2mm兔角膜缘组织,撕去角膜内皮层,0.25%DispaseⅡ酶4℃消化18小时后,取角膜上皮层用0.25%胰酶+0.02%EDTA 37℃消化10分钟,1000转离心10分钟后,SHEM培养基重悬接种于6孔培养板内,37℃、体积分数5%CO2孵育箱中培养,正常换液、传代。3、用流式细胞技术检测培养MSCs CD29、CD34表达情况。4、用免疫荧光染色法检测培养的兔LSCs CK3、Integrinβ1和p63的表达情况。5、取BrdU标记的兔MSCs,在以下四种不同条件下诱导培养三天。（同时设正常培养MSCs作为阴性对照组）A组:应用Transwell细胞培养板联合培养兔MSCs和兔LSCs,兔MSCs接种于培养板的上层,兔LSCs接种于培养板的下层,培养基为新鲜SHEM培养基B组:应用条件培养基培养兔MSCs,条件培养基为培养过兔LSCs的SHEM培养基上清C组:应用新鲜SHEM培养基直接培养兔MSCsD组:应用添加10ng/ml EGF的DMEM培养基培养兔MSCs6、用免疫荧光染色和流式细胞术检测不同时间点,各组MSCs表达CK3的情况。7、在上述四组体外培养系统中添加表皮生长因子抑制剂（AG1478）诱导培养三天（同时设正常培养MSCs作为阴性对照组）,用免疫荧光染色和流式细胞术检测不同时间点,各组兔MSCs表达CK3的情况。8、统计学处理:流式分析数据结果以均值±SD%表示,采用方差分析对各组结果进行比较。（P＜0.05有统计学意义）结果1、培养的兔MSCs和兔LSCs形态原代兔MSCs培养24小时后镜下观察有少量细胞贴壁,细胞呈长梭形,克隆样生长。12～15天达80%融合,传代后细胞状态无明显改变。原代培养兔LSCs培养24小时后大多数细胞贴壁,细胞呈不规则多角形,体积较小。接种3～4天形成含有8～10个细胞的小克隆,10～14天达80%融合,传代后细胞状态无明显改变。2、培养的兔MSCs和兔LSCs表型（1）兔MSCs的流式细胞鉴定:培养的兔MSCs CD29表达阳性的细胞占总细胞数的97.05%;而CD34阳性的细胞占5.15%。（2）兔LSCs的免疫荧光鉴定:培养的兔LSCs Integrinβ1、p63表达阳性,CK3呈阴性表达。3、体外诱导培养后兔MSCs的检测（1）诱导后兔MSCs的形态和表型特征:四组不同条件诱导培养的兔MSCs,均有部分细胞失去原有的成纤维细胞形态,分化为扁平的上皮细胞形态细胞,免疫荧光染色结果显示细胞表达CK3。CK3表达最早出现在诱导培养后的2小时,并在诱导培养的三天内无明显改变。（2）诱导率分析:流式分析结果显示,诱导培养第二天各组CK3表达量均有所升高（A组从3.46±1.9%增加到7.24±3.8%;B组从4.09±1.84%增加到9.31±5.92%;C组从3.48±1.39%增加到5.61±3.82%;D组从1.84±0.47%增加到4.73±3.94%）,但第三天均有所降低（A组5.5±3.33%;B组4.37±2.61%;C组2.54±2.01%;D组1.68±0.88%）。各组与对照组比较差异具有统计学意义,但各组间的差异不具有统计学意义。4、加入抑制剂诱导培养后兔MSCs的检测（1）免疫荧光染色结果:A组和B组兔MSCs在诱导培养后2小时,有部分贴壁细胞分化为扁平细胞形态的细胞,并表达CK3,而后随时间的延长未见CK3表达增加。C组和D组未见CK3表达阳性的细胞。（2）流式分析结果:诱导培养三天内A组CK3表达率第一天为1.44±0.18%,第二天升高到1.88±0.69%,第三天略有降低（1.76±0.15%）;B组CK3表达率在第一天为1.3±0.28%,第二天增高到2.73±0.45%,24小时后降低到2.3±1.11%;C组和D组CK3表达率基本稳定（C组第一天0.78±0.16%,第二天0.68±0.14%,第三天0.73±0.16%;D组第一天0.62±0.11%,第二天0.7±0.12%,第三天0.56±0.1%）。其中A组与B组间差异无统计学意义,但与对照组比较差异有统计学意义（p＜0.05）。C组与D组间差异也无统计学意义,与对照组间比较差异无统计学意义。但A组与C组、D组间差异有统计学意义（均p＜0.05）,同样B组与C组、D组间差异也具有统计学意义（均p＜0.05）。结论骨髓间充质干细胞可以在体外诱导分化为角膜上皮样细胞,EGF是参与这一分化过程的重要因子之一。
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