实验性大鼠脑缺血后脑红蛋白的动态表达及保护机制研究

论文摘要

目的:脑血管病是临床常见病和多发病,以其高发病率、高致残率和高病死率,严重影响着患者的预期寿命和生活质量,其中缺血性脑血管病占全部脑血管病的70%。脑梗死损伤的机制十分复杂,缺乏有效的干预手段。目前认为参与脑梗死损伤的病理生理机制与细胞内钙超载、细胞凋亡、兴奋性氨基酸的兴奋毒性、氧自由基产生过多所致的氧化应激等因素有关。出血性脑梗死（hemorrhagic infarction,HI）又称脑梗死后出血性转变（hemorrhagic transformation,HT）是急性缺血性脑卒中的常见并发症。近年来由于抗凝与溶栓治疗的广泛应用,CT等影像学检查的普及,关于HI的报道逐渐增多,但确切病理生理机制尚不清楚,亦无确定有效的治疗方法。脑红蛋白（neuroglobin,Ngb）是2000年由Burmester等德国科学家首先发现的一种新的携氧球蛋白,广泛表达于神经组织,在神经系统氧的摄取、运输和利用等生理过程中起重要作用。研究发现缺氧、缺血条件下Ngb表达升高,并且对神经系统缺氧、缺血损伤具有重要的神经保护功能。Ngb在mRNA和蛋白水平均可被氯化血红素（Hemin）所诱导,并呈时间和浓度依赖性。免疫共沉淀实验证明Na+,K+-ATP酶β2亚基与Ngb以复合物的形式存在,推测Ngb有可能通过对Na+,K+-ATP酶所具有的离子环境内稳态的调节功能发挥神经元保护作用。本研究拟通过观察大鼠脑梗死模型、出血性脑梗死模型中Ngb的动态表达及Hemin对其表达的影响,探讨Ngb对脑保护的可能机制,以期为临床采用Ngb刺激物治疗缺血缺氧性疾病提供理论根据。方法:200只SD大鼠随机分为4组,即大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型组,出血性脑梗死（hemorrhagic infarction,HI）模型组,Hemin干预组和假手术对照组。缺血模型组在模型建立成功后3-、6-、12-和24 h 4个时间点随机分为4个亚组。参照Longa等的线栓法制作大鼠MCAO模型;采用本实验室的方法制备HI模型;假手术对照组不插线,不注血。在相应时间点对大鼠进行行为学评分后过量麻醉断头处死,取出完整的脑组织,分别行苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色检测、TTC染色测定脑梗死体积、干-湿重法测定脑组织含水量、无机磷法测定Na+,K+-ATP酶活性、RT-PCR测定Ngb、Na+,K+-ATP酶α1亚基、α3亚基mRNA表达。结果:1脑组织含水量测定:MCAO组脑组织含水量于12 h开始升高（82.72±1.02）%,24 h显著升高（85.36±1.23）%。HI组水肿在12 h时即显著升高（85.28±0.64）%,较假手术组有显著性差异,并持续到24 h（85.19±0.96）%（P<0.01）。Hemin干预组脑组织含水量12 h（81.27±1.25）%开始升高,至24 h含水量较MCAO组（85.36±1.23）%和HI组（85.19±0.96）%差异均有显著性（P<0.01）。2脑梗死体积测定:缺血6 h时梗死体积明显增大,至24 h梗死体积达到最大。与MCAO组和HI组比较,Hemin处理组在缺血6 h后脑梗死体积差异均有显著性（P<0.01）,MCAO组和HI组之间比较,梗死体积无明显变化。3 Na+,K+-ATP酶活性测定:HI组Na+,K+-ATP酶活性自3 h（2.809±0.346）U/mgprot开始较MCAO组（4.565±0.776）U/mgprot、Hemin干预组（5.539±1.366）U/mgprot和假手术组（5.612±0.615）U/mgprot差异均有显著性（P<0.01）。缺血24 h Hemin干预组（4.793±1.310）U/mgprot较MCAO组（3.002±0.442）U/mgprot和HI组（2.162±0.101）U/mgprot差异均有显著性（P<0.05）,与假手术组比较无明显差异。4脑组织切片HE染色观察:假手术组及各缺血模型组早期脑组织很少炎细胞浸润。脑梗死后6 h神经元细胞水肿,病变周围少量炎细胞浸润,12 h梗死周围及炎细胞浸润开始增多,24 h可以见到大量以中性粒细胞为主的炎性细胞。HI组可见梗死中心区血肿,大量的含铁血黄素使细胞呈黄色或棕色,脑组织水肿、坏死,可见炎细胞浸润。Hemin处理组显示轻度缺血水肿改变,缺血范围减小,染色无明显变淡。5脑组织Ngb免疫组织化学结果:MCAO组、HI组缺血区Ngb阳性神经元数量较Hemin处理组对应区域减少。HI组早期Ngb阳性细胞数较MCAO组有一过性升高。随着缺血时间的延长,正常形态结构的阳性细胞数减少,至缺血24 h,Ngb阳性细胞几乎无表达。6 Ngb mRNA、Na+,K+-ATP酶α1亚基、α3亚基表达:缺血6 h后Ngb mRNA的表达在各组之间比较差异均有显著性（P<0.01）。6 h时MCAO组Ngb mRNA的表达（0.294±0.031）较其他各组差异均有显著性（P<0.01）。Hemin干预组的表达变化不明显,至24 h仍显著高于MCAO组（0.396±0.032）（P<0.01）。HI组在6 h短暂升高（0.518±0.034）后降低（0.439±0.114）,但与MCAO组比较差异仍有显著性（P<0.01）。Na+,K+-ATP酶α1亚基的表达在缺血模型组中无显著性变化,但较假手术组差异均有显著性（P<0.01）;仅在缺血12 h时,HI组（0.708±0.009）α1亚基mRNA表达显著升高,与MCAO组和Hemin干预组比较差异有显著性（P<0.01）。α3亚基mRNA在缺血6 h时MCAO组的表达（0.774±0.136）显著高于Hemin干预组（0.537±0.071）（P<0.05）,12 h时（0.440±0.072）较Hemin干预组（0.624±0.103）显著减少（P<0.05）,至24 h两组之间无显著差异,但较假手术组差异均有显著性（P<0.05）。HI组较MCAO组和Hemin干预组间差异无显著性。结论:1 Hemin干预后Ngb在mRNA和蛋白水平表达增加。2 Hemin干预组脑水肿减轻,脑梗死体积减小,Na+,K+-ATP酶活性升高,可能与Ngb表达增多有关。3 Na+,K+-ATP酶α3亚基mRNA的表达与Na+,K+-ATP酶活性变化趋势相似,可能由于α3亚基对缺血更为敏感,Na+,K+-ATP酶主要通过α3亚基的变化调节来其活性。4 HI组也可见Ngb表达增多,却表现脑水肿加重,Na+,K+-ATP酶活性减低,可能是由于血肿中血红蛋白分解产物高铁血红素刺激Ngb表达的同时,血肿释放的炎症因子等其他化学物质导致继发性脑损伤,加重了原有病情。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 实验性大鼠脑缺血后脑红蛋白的动态表达及保护机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 脑红蛋白与缺血缺氧性脑损伤
• 致谢
• 个人简历