表达RV ERA株G蛋白重组新城疫病毒的构建及免疫原性研究

论文摘要

狂犬病（Rabies）又名恐水症,是由狂犬病病毒（Rabies Virus,RV）引起的,侵害中枢神经系统的急性病毒性人兽共患传染病。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病,一旦发病,病死率高达100%。狂犬病主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家。近年来,我国狂犬病的发病率呈不断上升之势,仅次于印度居全球第二位。流行病学调查表明:95%以上的人狂犬病病例是因为与患病或带毒的犬或猫直接接触而引起的。狂犬病病毒糖蛋白（Rabies Virus Glycoprotein,RVG）是目前人们在狂犬病病毒结构和免疫学方面研究最为深入的蛋白。RVG是一种跨膜蛋白,以三聚体的形式定位于病毒的表面,构成表面的纤突,是病毒的主要表面抗原。RVG是病毒与宿主细胞结合的配体,能与细胞表面受体互作,介导病毒与靶细胞的结合。RVG不但与病毒的毒力、致病性密切相关,而且是狂犬病病毒的有效的保护性抗原,可诱导机体产生中和抗体和刺激细胞免疫,保护机体抵抗病毒感染。负链RNA病毒反向遗传操作系统（reverse genetic system,RGS）的成功建立使新城疫病毒（NDV）成为最具应用价值的活病毒表达载体。经过多年的临床应用,表现出非凡的优势:NDV遗传稳定,毒株间发生重组及毒力返强的可能性极小;NDV在哺乳动物和人类中仅发生一过性感染,对人类没有潜在危险;NDV具有高滴度的鸡胚生长特性,生产成本低廉,便于规模化生产。NDV作为疫苗载体具有广阔的应用空间和巨大的经济意义。在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上,构建表达RV ERA株糖蛋白的重组新城疫病毒rL-RVG,并探索rL-RVG对小鼠免及比格犬的免疫原性。利用RT-PCR技术,从狂犬病病毒ERA疫苗株上得到狂犬病病毒的糖蛋白基因,将其克隆到载体pBRN-FL-PmeI上,构建了表达狂犬病病毒糖蛋白重组新城疫病毒全长cDNA克隆pBRN-FL-RVG。利用磷酸钙转染法,在辅助质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L的共同作用下,拯救重组病毒rL-RVG。RT-PCR检测证实重组病毒rL-RVG基因组中含有RVG基因;Western Blot和IFA检测结果均表明RVG基因在新城疫载体中得到了正确、稳定的表达;大剂量接种BALB/c小鼠不会引起小鼠发病和生长阻滞,并能诱导出高水平ERA特异中和抗体反应;加强免疫后可有效抵御致死剂量RV街毒对BALB/c小鼠的攻击;持续监测比格犬ERA特异中和抗体水平表明具有良好的免疫原性。重组病毒rL-RVG有望成为防制狂犬病更加安全、有效的,新型重组基因工程活载体疫苗。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 狂犬病概述
• 1.1.1 我国狂犬病流行现状
• 1.2 狂犬病病毒分子生物学特征
• 1.2.1 RV 分类
• 1.2.2 RV 的形态结构
• 1.2.3 RV 的生物合成
• 1.2.4 RV 的血清型
• 1.2.5 RV 基因组结构与功能
• 1.2.6 RV 的结构蛋白与功能
• 1.3 狂犬病疫苗的研究进展
• 1.3.1 灭活疫苗
• 1.3.2 减毒活疫苗
• 1.3.3 基因工程疫苗
• 1.3.4 重组活载体疫苗
• 1.4 反向遗传操作系统概述
• 1.4.1 反向遗传操作系统
• 1.4.2 负链RNA 病毒反向遗传操作系统
• 1.4.3 负链RNA 病毒反向遗传操作系统的应用研究
• 1.5 新城疫病毒反向遗传操作系统的研究进展
• 1.5.1 新城疫病毒反向遗传操作系统概述
• 1.5.2 成功表达外源基因的重组新城疫病毒
• 1.5.3 表达RVG 的重组新城疫病毒
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒株、细胞、重组质粒及鸡胚
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器和耗材
• 2.1.4 试验动物
• 2.1.5 引物设计与合成
• 2.2 方法
• 2.2.1 病毒基因组的提取、反转录和PCR 扩增
• 2.2.2 目的DNA 片段与质粒载体的连接反应
• 2.2.3 连接产物的转化
• 2.2.4 阳性质粒的鉴定
• 2.2.5 表达RVG 重组NDV 基因组全长cDNA 的构建
• 2.2.6 表达RVG 重组病毒的拯救
• 2.2.7 重组病毒rL-RVG 的鉴定
• 2.2.8 重组病毒rL-RVG 的致病性试验
• 2.2.9 重组病毒rL-RVG 生长动力学比较研究
• 2.2.10 重组病毒rL-RVG 对小鼠的安全性试验
• 2.2.11 重组病毒rL-RVG 对小鼠的免疫试验
• 2.2.12 重组病毒rL-RVG 免疫小鼠对GX/09 街毒的攻毒保护试验
• 2.2.13 重组病毒rL-RVG 对比格犬的免疫试验及中和抗体水平的监测
• 3 结果与分析
• 3.1 RVG 基因的PCR 扩增结果
• 3.2 pBRN-R-RVG 的酶切及PCR 鉴定结果
• 3.3 重组病毒rL-RVG 的RT-PCR 鉴定
• 3.4 重组病毒rL-RVG 的间接免疫荧光试验
• 3.5 Western-blot 检测重组病毒RVG 的表达
• 3.6 重组病毒rL-RVG 的遗传稳定性
• 3.7 重组病毒rL-RVG 的致病性试验
• 3.8 重组病毒rL-RVG 鸡胚生长动力学
• 3.9 重组病毒rL-RVG 对小鼠的安全性评估
• 3.10 重组病毒rL-RVG 免疫小鼠的中和抗体检测试验
• 3.11 重组病毒rL-RVG 免疫小鼠对RV GX/09 街毒的攻毒保护试验
• 3.12 重组病毒rL-RVG 对比格犬免疫持续期抗体水平的监测
• 4 讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文