促血小板生成素双荧光素酶活性检测方法的建立

论文摘要

促血小板生成素（TPO）在促进造血干细胞和巨核细胞的生长、成熟、分化的整个过程中具有重要的作用,在临床上对于治疗由化疗或其他疾病引起的血小板减少症有显著疗效。合成TPO类似物或TPO模拟肽成为近些年的研究热点,大量候选的化合物或蛋白需要一种稳定高效的检测系统。本实验建立了一种在细胞水平上针对TPO模拟肽稳定、特异性高的检测方法。利用TPO激活其受体c-mpl介导的JAK-SATA途径,建立一种双荧光素酶检测系统。将c-mpl、c-fos-luciferase与内参对照renilla同时转入NIH3T3细胞中。表达48h后加入特比澳（阳性对照药物,重组人血小板生成素注射液）或TPO模拟肽,TPO与其受体c-mpl结合,引起受体双体化,激活下游STAT磷酸化,磷酸化后的STAT二聚体化,进入细胞核内,与c-fos启动子结合,启动下游萤火虫荧光素酶的表达。通过对萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的荧光强度进行检测,计算出相对荧光比率,实现对TPO或TPO模拟肽的活性的检测目的。通过转染GFP并检测GFP表达量确定NIH 3T3细胞的最佳转染条件,通过探索共转染质粒比例、阳性药浓度等条件优化并确立了双荧光素酶检测方法,最终确定检测条件为:使用24孔板,细胞密度为3×104VC/孔,DNA（μg）与脂质体（μl）的比率为1:2.5,共转染四质粒的比例为:c-mpl:c-fos:Renilla:pAdVAntage =5:2:0.1:2。利用双荧光素酶检测系统,成功检测到对照品特比澳的活性。并利用此检测方法,对本实验室构建的TPO模拟肽摇瓶酵母表达上清进行了初步筛选。选取11#2-3菌株发酵罐扩大培养,对发酵罐提纯产物进行了检测。结果显示,11#2-3菌株所表达的TPO模拟肽具有良好的生物活性,该模拟肽由1.7045μg/mL至27.2727μg/mL,与对照相比均具有显著性差异（P<0.001）,在1.7045μg/mL至27.2727μg/mL范围内荧光响应呈浓度依赖性。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 促血小板生成素
• 1.1.1 促血小板生成素的生物学作用
• 1.1.2 促血小板生成素的结构
• 1.1.3 促血小板生成素的信号传导途径
• 1.1.4 促血小板生成素的体外检测方法
• 1.2 C-MPL
• 1.3 C-FOS启动子
• 1.3.1 C-FOS结构
• 1.3.2 C-FOS的调节机制
• 1.4 双荧光素酶检测系统
• 1.5 检测方法原理
• 1.6 研究内容与立论依据
• 第二章 真核表达载体构建
• 2.1 实验材料和器材
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验器材
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 GFP-PCDNA3.1真核表达载体的构建
• 2.2.2 C-MPL-PCDNA3.1真核表达载体的构建
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 GFP-PCDNA3.1真核表达载体的鉴定
• 2.3.2 C-MPL-PCDNA3.1真核表达载体的鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 GFP-PCDNA3.1真核表达载体的构建
• 2.4.2 C-MPL-PCDNA3.1真核表达载体的构建
• 2.5 结论
• 第三章 双荧光素酶检测系统的构建和应用
• 3.1 实验材料和器材
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验器材
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 NIH-3T3细胞培养
• 3.2.2 NIH 3T3细胞转染条件的摸索
• 3.2.3 双荧光素酶检测系统的构建
• 3.2.4 双荧光素酶检测系统的应用
• 3.3 结果
• 3.3.1 NIH 3T3细胞转染条件
• 3.3.2 共转染质粒比例对荧光强度的影响
• 3.3.3 阳性对照药特比澳浓度对荧光强度的影响
• 3.3.4 双荧光素酶检测系统的应用
• 3.4 讨论
• 3.4.1 NIH 3T3细胞转染条件的摸索
• 3.4.2 共转染质粒比例对荧光强度的影响
• 3.4.3 阳性对照药特比澳浓度对荧光强度的影响
• 3.4.4 血小板生成素模拟肽摇瓶培养酵母表达上清粗检
• 3.4.5 血小板生成素模拟肽发酵罐初步纯化产物的检测
• 3.5 结论
• 参考文献
• 致谢