苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白的定点突变及结构与功能研究

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是世界上应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于芽胞形成过程中产生的杀虫晶体蛋白,研究杀虫晶体蛋白的结构与功能的关系成为当前的一个热点。Cry1Ac蛋白是目前所知的对鳞翅目昆虫毒性最高蛋白分子之一,在农作物和森林害虫防治、蚊虫控制及水生态系统中害虫防治都具有广泛的应用,但其结构与功能的关系尚未完全明确,需要运用定点突变技术进一步阐释。本论文运用分子生物学理论和生物信息学技术,发现了Cry1Ac5蛋白结构域Ⅲ中独特的β18-β19 loop,通过定点突变技术研究了Cry1Ac5蛋白结构与功能的关系,同时还获得了杀虫活性或稳定性提高的突变子。主要创新的研究内容如下:从高毒力的Bt4.0718菌株中分离克隆了cry1Ac5全长基因,利用穿梭载体pHT315构建了表达载体pHTAc35,电转入无晶体突变株cry-B中,高效表达了130 kDa的Cry1Ac5蛋白,为研究Cry1Ac5蛋白结构与功能提供了前提条件。利用Swiss-Model服务器和Swiss-pdb Viewer软件建立了Cry1Ac5蛋白的三维结构模型,并利用Clustal W和DS ViewerPro软件对比分析了其与其它Cry蛋白之间的差异,发现Cry1Ac5的结构域Ⅲ与其它Cry1蛋白的亲缘关系较远,其结构域Ⅲ上的β18-β19 loop比Cry1Aa、Cry2Aa、Cry3Aa和Cry4Aa蛋白对应的loop长,其组成的残基中色氨酸（W544）、连续的丝氨酸（S547、S548）和loop顶点的天冬酰氨（N546）在Cry蛋白中都是独特的残基分子成分。对β18-β19 loop上的7个残基进行丙氨酸扫描突变,所有突变子（N543A、W544A、G545A、N546A、S547A、S548A、I549A）都能产生菱形晶体和表达130 kDa的蛋白。室内生测表明,突变子N546A对棉铃虫和甜菜夜蛾的致死率有明显提高,而W544A的致死率则显著下降;对Cry1Ac5蛋白分子的三维结构分析表明,N546、S548的侧链伸向蛋白分子表面,可能参与蛋白与其受体分子的相互作用,而W544、G545、S547和I549的侧链伸向蛋白分子内侧,可能与维持蛋白的稳定性有关。对N546进一步突变,获得了突变子N546G、N546D、N546K和删除突变N546Δ及3个双突变和1个三突变,利用等电点沉淀法和AKTApurifier 100系统纯化了毒素蛋白,生测发现N546A(LC50为1.67μg/mL)对棉铃虫毒力比野生型Cry1Ac(LC50为2.98μg/mL)提高了1.78倍,而N546D、N546K和N546Δ的毒力则降低了80～90%。对野生和突变蛋白进行寡聚体形成能力和胰蛋白酶敏感性分析,发现N546不参与寡聚体的形成和维持蛋白的稳定。利用生物素标记蛋白法进行毒素蛋白与昆虫中肠BBMV的竞争和非竞争结合分析,发现N546A的初始结合能力比野生型增强了2倍;N546D初始结合能力与野生型相当,很容易被野生型Cry1Ac竞争;其它N546突变子与BBMV的初始结合能力则明显下降。因此,N546A突变蛋白毒力的强弱与其同昆虫BBMV的结合力强弱一致。进一步对W544突变获得保守的W544F、W544Y和不保守W544C突变子,生测和稳定性分析发现544位残基分子结构有无芳香环不是蛋白功能必须的,但亲水的侧链不利于蛋白的稳定;SDS-PAGE分析发现突变子W544F的原毒素明显的增加了蛋白对紫外线、胰蛋白酶和存贮的稳定性;经原子力显微镜观察,W544F产生的晶体两个顶点间的垂直距离比野生型Cry1Ac长0.6μm;W544F与野生Cry1Ac的杀虫活性相似,但经过紫外照射9 h后,其保留的杀虫活性比野生型高4倍以上,这一结果对解决Cry1Ac毒素蛋白田间应用的问题,具有重要的应用价值。本论文首次发现了Cry1Ac5蛋白结构域Ⅲ上的β18-β19 loop结构的特殊性,并第一次报道了结构域Ⅲ中的loop结构在蛋白功能中发挥的作用,为Cry1Ac的结构域Ⅲ在受体分子的识别和结合、维持蛋白的结构稳定等方面的重要性提供了新的生物学证据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 苏云金芽胞杆菌的生物学特性
• 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白
• 1.2.1 杀虫晶体蛋白基因
• 1.2.2 杀虫晶体蛋白的命名与分类研究
• 1.2.3 杀虫晶体蛋白的结构和功能
• 1.3 定点突变技术及其发展
• 1.4 杀虫晶体蛋白定点突变的研究进展
• 1.4.1 结构域Ⅰ的突变
• 1.4.2 结构域Ⅱ的突变
• 1.4.3 结构域Ⅲ的突变
• 1.4.4 定点突变增强 Bt 蛋白毒力的进展
• 1.5 立题依据和意义
• 第二章 Bt cry1Ac 基因的克隆和表达
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 Bt4.0178菌株质粒的提取及 cry1Ac 基因的鉴定
• 2.2.2 全长序列的 cry1Ac 基因的 PCR 扩增
• 2.2.3 中间重组质粒 pUAc19的构建
• 2.2.4 表达载体 pHTAc35的构建
• -B 和鉴定'>2.2.5 表达载体 pHTAc35电转化无晶体突变株 cry^-B 和鉴定
• 2.2.6 Cry1Ac 的表达
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 Cry1Ac5蛋白的分析和突变位点确定
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 目标蛋白序列
• 3.1.2 软件和数据库
• 3.1.3 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 Cry1Ac5与其它 Cry1A 蛋白的比较
• 3.2.2 Cry1Ac5蛋白的结构域Ⅲ的特点
• 3.2.3 β18-β19 loop 在 Cry1Ac5蛋白三维结构中的位置
• 3.2.4 β18-β19 loop 的特点
• 3.2.5 Cry1Ac5与其它 Cry 蛋白的β18-β19 loop 比较
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 Cry1Ac5蛋白β18-β19 loop 丙氨酸扫描突变
• 4.1.材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 Cry1Ac 蛋白的丙氨酸扫描突变
• 4.2.2 突变子表达载体的构建
• -B 宿主菌中的表达'>4.2.3 突变子在 cry^-B 宿主菌中的表达
• 4.2.4 突变株生物活性测定分析
• 4.2.5 软件分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 环形突变法定点突变的原理和关键点
• 4.3.2 模板选择和突变效果
• 4.3.3 突变前后的变化
• 4.4 小结
• 第五章 N546的定点突变及其功能分析
• 5.1.材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 突变子的测序结果分析
• 5.2.2 突变子 SDS-PAGE 分析
• 5.2.3 生测分析
• 5.2.4 毒素蛋白的纯化
• 5.2.5 N546在 Cry1Ac5蛋白活性发挥中的作用
• 5.2.6 突变前后三维结构的变化
• 5.3 讨论
• 5.3.1 N546在 Cry1Ac5蛋白中的作用
• 5.3.2 N546A 突变子增强蛋白活性的机理
• 5.3.3 N546突变影响蛋白功能变化的机理
• 5.4 小结
• 第六章 W544的定点突变及其功能分析
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 W544在 Cry1Ac 三维结构中的作用
• 6.2.2 W544突变子的测序结果
• 6.2.3 W544突变子的镜检和 SDS-PAGE 分析
• 6.2.4 毒力生测
• 6.2.5 稳定性分析
• 6.2.6 突变前后结构变化比较
• 6.2.7 W544F 与野生 Cry1Ac 晶体的形态比较
• 6.2.8 W544F 紫外线处理后的生测分析
• 6.3 讨论
• 6.3.1 W544在 Cry1Ac 蛋白中作用
• 6.3.2 W544突变蛋白稳定性与杀虫活性之间的联系
• 6.3.3 W544F 增强蛋白稳定性的意义
• 6.4 小结
• 第七章 主要结论和今后的研究设想
• 7.1 本研究的主要结论
• 7.2 本研究的创新点和科学意义
• 7.3 今后的研究设想
• 参考文献
• 攻读博士学位期间撰写和发表的论文
• 致谢