青藏高原水环境中H5N1亚型流感病毒的分离鉴定及其遗传演化分析

论文摘要

2005年5-7月,我国青海湖及周边区域首次出现大量候鸟死于H5N1亚型高致病性禽流感。由于部分候鸟具有在水环境中生活的习性,所以水体成为禽流感病毒重要的高危载体。为了了解青藏高原禽流感发生及传播模式,本研究建立了一种硝酸纤维素膜过滤的方法检测水环境中的禽流感病毒,应用此方法从青海湖周边水环境样品中分离出一株高致病性H5N1亚型流感病毒,并对其致病性、生物学特性、遗传变异等进行了研究。从而为揭示流感病毒引起的病理学变化规律及其传播机制提供科学依据。用硝酸纤维素膜过滤法对自来水和生活污水中的禽流感病毒进行浓缩,回收率分别为96.14%和93.44%,二者无显著差异。实验中对禽流感病毒做10倍系列稀释再回收,回收率随病毒浓度变化不明显,应用本方法均可以有效起到回收病毒的作用。在自来水中,当病毒的投放浓度达96PFU/L以上时,回收率均在78.13%以上。在污水中,当投放浓度达到96PFU/L时,回收率为47.92%,比自来水中的回收率有所下降。本试验比较了甘氨酸缓冲液、牛肉膏溶液、磷酸缓冲液3种最为常用的洗脱液在不同pH条件下（7、9.5、11）的最佳洗脱效果。试验结果表明,当pH9.5,O.1mol/L甘氨酸缓冲液作为洗脱液时的病毒回收率最高。用本方法对青海地区水样品进行分离浓缩,结果分离出一株高致病性H5N1流感病毒。从致病性试验可知,此分离株流感病毒感染鸭只后24h,在鸭的肺、肾、肝、脾、脑和胸肌中可检测到病毒。感染后36h时机体内病毒含毒最高;到60h时机体含毒量下降,在肝、脾、肾检测不到病毒的存在,而在肺、脑、胸肌病毒含量仍基本维持峰值,小鼠感染流感病毒后变化趋势和鸭只感染后的变化趋势几乎一致,唯一不同的是在感染后60h在肌肉中检测不到流感病毒,说明流感病毒具有组织嗜性。用无特定病原体（SPF）鸡胚增殖病毒,提取鸡胚尿囊液中的病毒总RNA,设计禽流感病毒的8个基因的引物,通过反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术分别扩增分离株的8个基因片段的全序列cDNA,将其分别克隆在PMD18-T载体上进行鉴定和序列测定。结果表明扩增的8个基因片段均包含H5N1流感病毒相应的完整开放阅读框架。用DNAStar分析软件对本分离株与11株禽流感病毒的基因组的8个基因序列进行分子遗传演化分析,结果表明本分离株的HA基因与欧亚种系分离株Shandong/2003同源性为98.6%,且在同一进化分支上;而与北美代表株Ireland/1983同源性为86%,且在相距较远的进化分支上,此比较结果表明本分离株起源于欧亚种系。本分离株HA裂解位点的氨基酸序列为PQRERRRKKR,且连续多于5个碱性氨基酸,说明其为高致病性流感病毒株。而其它7个基因的核苷酸同源性和分子演化分析显示,本分离株各基因与Shangdong/03株的相应基因的同源性均在95.7%以上,说明此两株的亲缘关系较近。因此,可以推测本试验分离株Qinghai/2007（H5N1）很可能是由03年山东猪流感毒株变异演化而来。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 文献综述
• 1 概述
• 2 禽流感病毒的基因组结构及其特征
• 3 病毒基因编码蛋白的结构和功能
• 3.1 血凝素
• 3.2 神经氨酸酶
• 3.3 核蛋白
• 3.4 基质蛋白
• 3.5 聚合酶
• 3.6 非结构蛋白
• 4 禽流感致病性的分子生物学基础
• 4.1 病毒与宿主细胞膜的融合
• 4.2 病毒的脱壳和核的进入
• 4.3 病毒的复制和转录
• 4.4 核的输出
• 4.5 病毒在质膜上的组装
• 4.6 病毒的出芽和释放
• 5 水体是病原体的高危载体
• 5.1 水环境中病原体的分布
• 5.2 水环境中病原体的存活
• 5.3 水环境样品中病毒的富集
• 5.4 水环境中病毒的检测
• 6 野生水禽在传播水体中高致病禽流感病毒中的作用
• 6.1 野生水禽是低致病性禽流感病毒的自然宿主
• 6.2 禽流感病毒在几种野生水禽中的分布情况
• 6.3 野生水禽中禽流感病毒的遗传变异
• 6.4 野生水禽中高致病性禽流感H5N1 病毒亚型
• 7 结语
• 引言
• 试验一 硝酸纤维素膜检测水源中流感病毒方法的建立及其初步应用
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 模拟样品制备
• 2.2 病毒回收浓缩
• 2.3 硝酸纤维素膜过滤方法的初步应用
• 3 结果与分析
• 3.1 H9N2 禽流感病毒的病毒计数
• 3.2 膜过滤法对自来水和生活污水中禽流感病毒回收率测定
• 3.3 不同洗脱液洗脱效果比较
• 3.4 采集的水样品的浓缩检测结果
• 3.5 分离毒株的初步鉴定
• 4 结论与讨论
• 试验二 青藏高原水源流感病毒H5 亚型分离株的致病性试验
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 TCID50 的测定
• 2.2 人工感染康贝尔鸭、Balb/C 小鼠试验的总体设计
• 3 结果与分析
• 3.1 TCID50 测定结果
• 3.2 眼观病理学检查
• 3.3 组织病理学检查结果
• 3.4 人工感染后各脏器病毒含量（ELD50）的测定结果
• 4 结论与讨论
• 试验三 青藏高原水源流感病毒H5 亚型分离株8 个基因片段的克隆及分子特征分析
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 病毒RNA 的提取
• 2.3 cDNA 合成
• 2.4 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.5 PCR 产物的电泳分析
• 2.6 流感病毒8 个基因片段的克隆
• 3 结果与分析
• 3.1 PCR 产物电泳鉴定结果
• 3.2 毒株测序结果
• 3.3 流感病毒各基因的同源性与分子遗传演化分析
• 4 结论与讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 英文摘要
• 攻读硕士期间发表的论文