论文摘要
稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）既是重要的经济作物-水稻稻瘟病病原，也是研究植物与微生物相互作用的重要模式生物。激发子（elicitor）是研究水稻与稻瘟病菌相互作用的过程中的重要对象。稻瘟病菌的很多分泌蛋白可能起激发子的作用，在已分析过的稻瘟病菌近1000个分泌蛋白中，很多是蛋白酶类，通过对病菌胞外分泌蛋白酶在各个生理时期表达的检测，可以加速对稻瘟病菌生物学、致病分子机制及水稻抗病机制的认识。本研究制备了两种稻瘟病菌蛋白酶α-甘露糖苷酶和几丁质酶的多克隆抗体。稻瘟病菌α-甘露糖苷酶多抗的制备是将过量表达α-甘露糖苷酶-His标签融合蛋白的稻瘟病菌的转化子在液体完全培养基中培养，收集上清中的胞外分泌蛋白，经Ni2+-NTA亲和柱纯化后，得到可溶的α-甘露糖苷酶。然后以α-甘露糖苷酶-His融合蛋白免疫新西兰雄兔，制备多克隆抗体。ELISA分析表明该抗体效价达1∶51200，特异性较好。用该抗体对30个稻瘟病菌田间菌株培养液进行ELISA检测和Western Blotting验证，结果表明不同菌株间α-甘露糖苷酶的表达量有明显差异。在亲和互作稻瘟病菌菌株70-15与C101A51 Pi-2组合中，随着侵染时间延长α-甘露糖苷酶的表达量增加；而在非亲和互作稻瘟病菌70-15与IRBL22组合中，则检测不到α-甘露糖苷酶的表达。稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）几丁质酶多抗的制备是将稻瘟病菌几丁质酶-His融合基因克隆入表达载体pET-32a，并在大肠杆菌E．coli BL21（DE3）中进行诱导表达。稻瘟病菌几丁质酶过表达菌株经0.5 mmol／L IPTG诱导4-6 h后，几丁质酶-His融合蛋白经Ni2+-NTA亲和柱纯化后，得到可溶的几丁质酶-His融合蛋白。以几丁质酶-His融合蛋白免疫新西兰雄兔，制备多克隆抗体。ELISA分析表明该抗体效价达1∶204800，特异性良好。该抗体对30个稻瘟病菌田间菌株培养液进行ELISA检测和Western Blotting验证，结果表明不同菌株间几丁质酶表达量有明显差异，稻瘟病菌菌株70-15感染不同时期的水稻，几丁质酶的表达量也表现出明显的差异。而稻瘟病菌几丁质酶表达的差异是否与菌株间致病性等生物学和生理学差异有关，有待进一步研究。