腺病毒介导NF-κB p65的siRNA抗大鼠移植肝缺血再灌注损伤的研究

论文摘要

背景:我国是世界上肝病发病率最高和因肝病导致死亡人数最多的国家之一,同时也是接受肝移植治疗的患者较多和肝移植发展较快的国家。肝移植后,肝脏无功能或肝衰仍然是一个重要的临床问题。同时,移植器官的短缺迫使人们不得不采用一些边缘供肝,而这些供肝对缺血再灌注损伤更敏感,使移植肝原发性功能障碍的发生率显著提高,这在相当程度上限制了肝移植的发展。如何避免这些损伤是目前肝移植研究领域的重点和热点。研究表明,肝移植缺血再灌注损伤过程中,NF-κB的激活导致其下游基因-炎性介质的大量表达,从而在移植后缺血再灌注损伤过程中发挥重要作用。因此,我们可以设想抑制NF-κB的激活或表达有望调节或减轻缺血再灌注损伤。RNAi技术可以高效沉默特定基因,去除移植过程中不利基因的表达,在器官移植方面具有广泛的应用前景。有效的基因治疗方案需要将目的基因稳定、高效地转入移植物的细胞。腺病毒载体因具有嗜肝性、能够转染处于非增殖期的实质细胞而在肝脏疾病研究方面具有优势。第一部分siRNA转染BRL细胞时转染条件的优化目的:探讨用RNAi-mate试剂转染siRNA至BRL细胞的最佳转染条件。方法:设立不同的2种RNAi-mate量和4种siRNA量,交叉组合成8个不同比例的复合物,即8个实验组,分别转染接种培养的BRL细胞,24小时后,观察细胞阳性转染率和细胞存活率。结果: siRNA的量为1.5ug,RNAi-mate为3.0ul时,其转染效率为89%,细胞的生存率为84%,优于其它条件时的转染效率并能保证相对小的细胞毒性。结论:在本实验中,用siRNA转染BRL细胞,当siRNA与RNAi-mate比例为1:2时,为最佳转染条件。第二部分siRNA对BRL大鼠肝细胞NF-κB p65表达影响的研究目的:筛选出能高效抑制NF-κB p65表达的siRNA序列。方法:设计制备4对针对大鼠NF-κB p65的siRNA,结合对照共分为7个实验组,采用研究一的转染条件体外转染培养的BRL细胞,采用逆转录PCR和Western blotting检测siRNA的基因沉默效果。结果:设计合成的4对siRNA均不同程度的从mRNA和蛋白表达水平抑制了BRL细胞NF-κB p65的表达,其中第二对siRNA mRNA和蛋白水平的抑制率分别为90%和80%。结论:4对siRNA转染BRL细胞后,均能发挥RNA干扰作用。第二对siRNA抑制效率最高。第三部分针对NF-κB p65的siRNA重组腺病毒的制备及病毒包装、扩增和滴度测定目的:构建针对NF-κB p65的siRNA重组腺病毒。方法:将NF-κB p65 shRNA表达框插到穿梭质粒pShuttle H1的启动子下游,鉴定包含目的基因的正确克隆,将其线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1体外同源重组,共转化感受态细菌,筛选重组子并扩增。重组子线性化后,转染293A细胞中进行病毒的包装,同时大量扩增病毒,氯化铯密度梯度离心纯化。重组腺病毒转染BRL细胞检测NF-κB p65基因沉默效率。结果:穿梭载体插入序列及重组腺病毒质粒的鉴定均完全正确。病毒扩增纯化后滴度为3.0×1010 pfu/ml,并能在体外抑制NF-κB p65蛋白表达。结论:成功构建了针对NF-κB p65的siRNA重组腺病毒。第四部分大鼠原位肝脏移植模型的建立目的:用改良二袖套法建立稳定的大鼠原位肝脏移植模型。方法:在Kamada“二袖套法”的基础上,在取肝、肝上下腔静脉的吻合、围手术期处理等几方面进行改良,共施行大鼠原位肝移植动物实验140例,观察术后并发症及存活率。结果:经过140例次的训练,建立了稳定的大鼠原位肝脏移植模型。在实验的第三阶段,受体无肝期平均12分钟,手术成功率93%,两周存活率90%。结论:改良的二袖套法具有无肝期短、手术成功率高、大鼠术后存活时间长的优点,是大鼠原位肝移植的理想术式。娴熟细致的外科操作、受体无肝期的长短是决定动物存活的关键。第五部分Ad-shRNA-p65在大鼠移植肝缺血再灌注损伤中的保护作用目的:观测构建的Ad-shRNA-p65腺病毒载体在大鼠体内的基因沉默效果及其在大鼠原位移植肝缺血再灌注损伤中的保护作用。方法:术前36小时将Ad-shRNA-p65通过门静脉注入实验组供体大鼠肝脏,3.0×109/只。移植术前处死一批大鼠,检测血ALT、AST、LDH,肝脏病理,NF-κB p65的mRNA、蛋白表达。供肝获取后冷保存4小时,改良的二袖套法行原位肝脏移植术。门静脉复流6小时后观测受体胆汁分泌情况,处死受体大鼠,检测血ALT、AST、LDH,肝脏病理,肝组织MDA水平,NF-κB p65的mRNA、蛋白表达以及免疫组化;TNF-α、MIP-2、ICAM-1mRNA表达,TNF-α的免疫组化,TUNEL法检测肝脏细胞凋亡水平。结果:移植术前,实验组NF-κB p65的mRNA、蛋白表达降低,实验组和空病毒组血生化指标升高。术后6小时,实验组胆汁分泌量多于对照组,血生化指标降低,MDA水平、NF-κB p65的mRNA、蛋白表达明显低于对照组,TNF-α、MIP-2、ICAM-1mRNA低表达,实验组细胞形态变化较轻,凋亡水平明显低于对照组。结论:构建的腺病毒载体Ad-shRNA-p65能成功地转染供肝,并有效沉默NF-κB p65表达,转染本身对供肝可能有轻微的损害。Ad-shRNA-p65预处理的供肝能够抑制移植肝缺血再灌注损伤引起的NF-κB p65激活和表达,并减轻移植肝的缺血再灌注损伤,其机制与下调TNF-α、MIP-2及ICAM-1表达,进而减少肝脏内中性粒细胞的浸润有关。

论文目录

• 中文提要
• Abstract
• 引言
• 参考文献
• 第一部分 siRNA 转染BRL 细胞时转染条件的优化
• 一 材料
• 二 方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 参考文献
• 第二部分 siRNA 对BRL 大鼠肝细胞NF-κB p65 表达影响的研究
• 一 材料
• 二 方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 五 结论
• 参考文献
• 第三部分 针对NF-κB p65 的siRNA 重组腺病毒的制备及病毒包装、扩增和滴度测定
• 一 材料
• 二 方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 五 结论
• 参考文献
• 第四部分 大鼠原位肝脏移植模型的建立
• 一 材料
• 二 方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 五 结论
• 参考文献
• 第五部分 Ad-shRNA-p65 在大鼠移植肝缺血再灌注损伤中的保护作用
• 一 材料
• 二 方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 五 结论
• 参考文献
• 全文总结
• 附图
• 附录
• 综述 NF-κB 的研究进展
• 攻读学位期间公开发表论文及参编著作
• 本课题资金项目
• 主要英文缩略词表
• 致谢
• 详细摘要