小鼠牙胚发育早期间充质细胞的蛋白质组研究

论文摘要

牙胚发育早期是牙齿定位与定型的重要阶段。大量研究表明,牙胚发育的起动期决定牙胚形成的位置;帽状期决定牙胚发育的类型,多种生物因子在上皮-间充质间发挥着重要的调控作用。蛋白质组学是一门主要研究蛋白质组的组成成份及生物学功能的新兴学科,从而可以在蛋白水平综合分析影响牙齿发育的调控机制。因此,本实验通过激光捕获显微分离技术分别获取小鼠牙胚发育早期（起动期E11.5天和帽状期E15.5天）的下颌磨牙间充质细胞,采用双向电泳、多级质谱和数据库查询的蛋白质组研究方案,分析小鼠磨牙牙胚发育早期间充质细胞所含蛋白质在数量、种类上的变化,进一步探讨影响牙齿发育的调控因素,以期寻找和发现新的关键因子,从而为牙胚发育研究提供一种新的思路。目的:1.熟练掌握小鼠牙胚发育起始期、蕾状期、帽状期、钟状期冰冻切片的制备方法;2.熟练掌握激光捕获显微切割技术,并捕获足够量的细胞样本（E11.5天及E15.5天下颌磨牙间充质细胞）;3.获得两组细胞的蛋白质双向凝胶电泳图谱,鉴定差异蛋白点,探讨两个时期影响牙胚发育的分子机制。方法:1.获得准确发育天数的C57胎鼠,制备小鼠下颌磨牙牙胚发育各期的冰冻切片;2.使用PixCell IIe激光捕获显微切割系统对冰冻切片上发育各期的间充质细胞进行分离,收集细胞样本至需要量;3.采用第一向等电聚焦电泳、第二向十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、硝酸银染色获得两组细胞样本的双向电泳图,图像分析软件比较差异蛋白点4.利用高效液相色谱-串联质谱仪获得差异蛋白点的一级、二级质谱图,以及蛋白氨基酸序列,通过蛋白质组数据库检索并结合差异蛋白质点的分子信息进行综合分析,鉴定差异蛋白。结果:1.获得E11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5天小鼠下颌磨牙牙胚冰冻切片;2.经激光捕获得到需要量的两组（E11.5牙胚起动期、E15.5牙胚帽状期）下颌磨牙间充质细胞;3.两组细胞双向电泳图获得20个差异蛋白点,其中15个点得到鉴定。质谱结果显示:E11.5组细胞新增蛋白为膜联蛋白A2、肌动蛋白β、丙酮酸激酶M;E11.5组细胞上调蛋白为ATP合成酶d亚单位、ATP合成酶α亚单位、转酮酶、β烯醇酶;E15.5组细胞新增蛋白为真核翻译延长因子2、乳酸脱氢酶B、M-Septin;E15.5组细胞上调蛋白为真核翻译延长因子1γ、核内核糖核蛋白H2、核内核糖核蛋白X、乳酸脱氢酶A、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶1γ。结论:1.通过阴栓观察及胎鼠身长测量相结合的方法,提高了胎龄判断的准确性和小鼠的利用率;2.经过对发育各阶段胎鼠头部进行连续冰冻切片,明确下颌磨牙牙胚的具体位置,大大提高了获得牙胚冰冻切片的效率;3.通过激光捕获显微切割技术成功获得目的细胞;4.通过差异蛋白点的鉴定及分析,获得的蛋白主要为细胞糖代谢及能量代谢相关蛋白酶、参与蛋白翻译合成、以及参与某些信号传导途径的信号分子等,这些蛋白分别在小鼠下颌磨牙牙胚发育起动期和帽状期间充质细胞中存在特异性表达或表达上调,为进一步研究牙胚早期发育的调控机制提供了新的线索。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 第一部分 牙胚生长发育机制
• 第二部分 激光捕获显微切割技术及其应用
• 第三部分 差异蛋白组学研究技术的进展
• 正文
• 实验一 小鼠下颌磨牙牙胚发育早期冰冻切片的制备及形态学观察
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 实验二 激光显微切割技术捕获小鼠下颌磨牙牙胚发育早期间充质细胞
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 实验三 小鼠下颌磨牙牙胚发育早期间充质细胞的蛋白质双向凝胶电泳
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 实验四 差异蛋白斑点的质谱分析及鉴定
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢