鸡肌苷酸相关候选基因遗传效应及表达规律研究

论文摘要

肌苷酸（Inosine monophosphate, IMP）是重要的风味物质,对肌肉的鲜味程度起着巨大作用,目前世界上已有不少国家以肌苷酸的含量作为肉类新鲜程度的指标之一。肌苷酸（IMP）在体内的合成代谢过程十分复杂,从头合成涉及十种关键酶。本研究以鸡肌苷酸合成代谢相关酶中的谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶（GPAT）基因、5-氨基咪唑核苷酸羧化酶/5-氨基咪唑-4-（N-琥珀酰胺）核苷酸合成酶（AIRC）基因和氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶/次黄嘌呤核苷酸环水解酶（PURH）基因为候选基因,采用PCR-SSCP和测序相结合的方法,在丝羽乌骨鸡、萧山鸡、白耳鸡、藏鸡等4个地方鸡种以及1个外来鸡种-隐性白羽肉鸡群体中对鸡GPAT、AIRC和PURH基因进行单核苷酸多态性（SNPs）扫描并分析其与肌肉肌苷酸含量之间的关系;利用相对定量RT-PCR法检测了ADSL、GARS-AIRS-GART、GPAT、AIRC和PURH等5个候选基因在白耳鸡不同组织中的时空表达规律;同时结合本实验室已有的对ADSL、GARS-AIRS-GART基因多态性研究结果,在白耳鸡群体中对ADSL、GARS-AIRS-GART、GPAT、AIRC和PURH基因进行多基因聚合分析,探讨不同基因组合之间合并基因型对肌肉肌苷酸含量的效应大小。主要研究结果如下:1.以鸡IMP合成代谢过程中紧密连锁的谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶（GPAT）基因、5-氨基咪唑核苷酸羧化酶/5-氨基咪唑-4-（N-琥珀酰胺）核苷酸合成酶（AIRC）基因为候选基因,对该两个基因的启动子区域、所有外显子和部分内含子区域进行单核苷酸多态性（SNPs）扫描。共检测出6个多态位点,分别为GPAT基因外显子2中29777处的碱基A缺失突变、内含子4中G34993A突变、内含子5中T35188A突变、AIRC基因外显子3中T1993C突变、外显子8中C5406G突变以及启动子区G-158C突变,将核苷酸序列翻译成相应的氨基酸序列后发现,位于编码区的突变均为沉默突变。2.在GPAT基因中,仅在外显子2的多态位点上存在显著的基因型效应,AA型个体胸肌IMP含量显著的高于AB型与BB型个体,AB型个体IMP含量稍高于BB型,但二者之间差异不显著。AIRC基因的两个多态位点在5个鸡种中均存在显著的基因型效应,在外显子3中CC型个体胸肌IMP含量显著高于TC型和TT型个体,TC型个体IMP含量均值稍高于TT型个体,但两者之间的差异不显著;而在外显子8中,CG型个体的胸肌IMP含量最高,并显著高于CC型和GG型个体,GG型个体IMP含量也显著地高于CC型个体。两基因启动子区的多态位点也与胸肌IMP含量之间存在着显著相关,GG型个体胸肌IMP含量显著高于GC型和CC型个体,GC型个体IMP含量稍高于CC型个体,但两者之间的差异不显著。推测GPAT/AIRC基因应是肌肉肌苷酸含量的主效QTL或与其主效QTL紧密连锁,有望用于标记辅助选择。3.以鸡IMP合成过程中的氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶/次黄嘌呤核苷酸环水解酶（PURH）基因为候选基因,对该基因的所有16个外显子、外显子/内含子的结合区域以及3’侧翼部分序列进行SNPs扫描。共检测到两个多态位点,分别为外显子9中的A8023T突变和外显子16中的T17446C突变（从转录起始位点开始计起所得到的核苷酸位置）,但这两个突变均为沉默突变,并没有导致对应的氨基酸序列发生变异。两个SNPs位点在不同鸡种中的基因型分布差异显著,进一步的关联分析显示,仅外显子16中的多态位点与肌肉IMP含量之间存在着显著的关联,其TT型个体胸肌IMP含量显著高于CT型与CC型个体,CT型个体IMP含量稍高于CC型,但二者之间差异不显著,初步认为该位点可以作为肌肉IMP含量的辅助选择标记。4.在白耳鸡群体中对肌苷酸合成相关酶基因（ADSL、GARS-AIRS-GART、GPAT、AIRC和PURH基因）在不同组织和肌肉中的表达规律进行了研究。结果在白耳鸡的不同生长阶段（3,6,9,12和15周龄）不同组织中均检测到了5个基因的mRNA,在某些时期的表达量上存在强弱之分,但没有发现有和无的差别,说明IMP合成过程中的5个基因是通过作用于一系列不同的组织器官而发挥其生理功能;并且ADSL、GARS-AIRS-GART、GPAT和PURH基因在所有组织中表达量的变化趋势基本一致,呈明显的时序性变化:12周龄前随着周龄的增加,表达量不断增加,在12周龄时达到最高,而后开始下降;而AIRC基因在不同组织中的表达随着周龄的增加并没有一定的规律,可能是由于其在不同组织中的表达存在特殊的调节机制。位于同一染色体上的基因（ADSL与GARS-AIRS-GART,GPAT与AIRC） mRNA表达量之间均存在显著或极显著的正相关,ADSL与AIRC、PURH与GPAT/AIRC基因mRNA表达量之间也存在显著的正相关,这些结果说明IMP合成涉及的关键酶的调控存在关联,它们之间存在着协同作用,并最终影响着肌苷酸的含量。5.在较大规模的白耳鸡群体中对IMP合成过程中的5个相关酶基因进行多基因聚合效应分析,分别分析了单基因、两基因、三基因、四基因以及五基因聚合后对胸肌IMP含量的影响效应大小,结果表现出五基因合并效应>四基因合并效应>三基因合并效应>两基因合并效应>单基因效应,合并基因型的效应不是各自基因型效应的简单相加,但却要高于最好的单个基因型效应,这提示我们在分析多基因控制的数量性状时,需要同时对多个位点组成的合并基因型（单倍型）进行分析,这样才能得到基因与性状之间的真实相关性,这个结论对于利用DNA标记进行辅助选择特别有意义,表明评估品种或种群的遗传改良必须以合并基因型的影响效应为准。

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第一章文献综述

1. 鸡的肉质风味研究进展

1.1 肉质风味的含义

1.2 肉品风味的产生

2. 肌苷酸作为风味物质的研究进展

2.1 肌苷酸的呈味作用

2.2 肌苷酸的合成代谢

2.2.1 肌苷酸的从头合成途径

2.2.2 肌苷酸的补救合成途径

2.2.3 由次黄嘌呤核苷酸转换成AMP 或GMP

2.2.4 屠宰后肌苷酸的形成

2.3 影响肌肉肌苷酸含量的因素

2.3.1 遗传因素

2.3.2 饲料组成

2.3.3 屠宰方法

2.3.4 保藏温度和时间

2.4 肌苷酸含量的遗传力及与其他性状间的相关

3. 肉质性状相关候选基因的研究进展

3.1 与肌苷酸合成代谢相关的基因

3.1.1 ADSL 基因

3.1.2 GARS-AIRS-GART 基因

3.1.3 GPAT 基因与AIRC 基因

3.1.4 PURH 基因

3.1.5 AMPD1 基因

3.2 与脂肪代谢相关性状的候选基因

3.2.1 心肌型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因

3.2.2 脂肪型脂肪酸结合蛋白（A-FABP）基因

3.2.3 细胞外脂肪酸结合蛋白（EX-FABP）基因

3.2.4 脂蛋白脂酶（LPL）基因

3.2.5 瘦蛋白受体（OBR）基因

3.2.6 解偶联蛋白（UCP）基因

4. 家禽肉质选择的主要方法

4.1 分子标记辅助选择在家禽育种中的应用

4.1.1 限制性酶切片段长度多态性（RFLP）

4.1.2 DNA 指纹标记

4.1.3 RAPD 标记

4.1.4 微卫星标记

4.1.5 SNP 标记

4.1.5.1 SNP 的基本概念

4.1.5.2 SNP 的检测方法

4.1.5.3 SNP 在畜禽遗传育种中的应用

4.1.6 几种新型分子标记

4.1.6.1 RMAPD 标记

4.1.6.2 SRAP 标记

4.1.6.3 TRAP 标记

4.2 候选基因法

4.2.1 候选基因法的基本概念

4.2.2 候选基因分析法的步骤

4.2.3 连锁关系的验证

4.2.4 候选基因分析法的不足

5.R T-PCR 定量技术

5.1 非竞争性RT-PCR 技术

5.2 竞争性RT-PCR 技术

5.3 RT-PCR 方法用于畜禽相关基因表达的研究

6 多基因聚合在优质鸡育种中的应用

6.1 优质鸡的概念

6.2 基因聚合育种的基本原理

6.3 基因聚合在畜禽育种中的研究进展

7. 本研究目的和意义

第二章肌苷酸合成相关酶基因单核苷酸多态性及其与鸡肉肌苷酸含量的关联分析

第一节鸡GPAT 基因和AIRC 基因的单核苷酸多态性及其与肌苷酸含量的关联分析

1. 引言

2. 材料与方法

2.1 试验动物

2.2 主要溶液的配制

2.3 主要实验仪器

2.4 引物设计合成

2.5 试验方法

2.5.1 胸肌肌苷酸含量的测定

2.5.2 基因组DNA 的提取

2.5.3 PCR 扩增

2.5.4 SSCP 分析

2.5.5 多态片段的序列测定

2.5.5.1 PCR 产物的直接测序

2.5.5.2 克隆测序

3. 相关软件及统计方法

3.1 相关软件

3.2 统计方法

3.2.1 基因频率、基因型频率在各群体中分布的差异检验

3.2.2 关联分析

4. 结果与分析

4.1 不同鸡种胸肌肌苷酸含量

4.2 GPAT 基因SNP 筛查结果

4.3 AIRC 基因SNP 筛查结果

4.4 GPAT/AIRC 基因启动子区域SNP 筛查结果

4.5 GPAT 基因各SNP 位点在5 个鸡群体中的基因频率和基因型分布

4.6 AIRC 基因各SNP 位点在5 个鸡群体中的基因频率和基因型分布

4.7 GPAT

4.8 GPAT 基因与12 周龄母鸡胸肌肌苷酸含量的关联分析

4.9 AIRC 基因与12 周龄母鸡胸肌肌苷酸含量的关联分析

4.10 GPAT/AIRC 基因启动子与12 周龄母鸡胸肌肌苷酸含量关联分析

5. 讨论

5.1 不同鸡种胸肌肌苷酸含量的比较

5.2 鸡GPAT 基因、AIRC 基因单核苷酸多态性

5.3 鸡GPAT 基因单核苷酸多态性与肌苷酸含量的关系

5.4 鸡AIRC 基因单核苷酸多态性与肌苷酸含量的关系

5.5 鸡GPAT/AIRC 基因启动子区单核苷酸多态性与肌苷酸含量的关系

第二节鸡PURH 基因的单核苷酸多态性及其与肌苷酸含量关联分析

1. 引言

2. 材料与方法

3. 结果与分析

3.1 PURH 基因SNP 筛查结果

3.2 PURH 基因各SNP 位点在5 个鸡群体中的基因频率和基因型分布

3.3 PURH 基因与12 周龄母鸡胸肌肌苷酸含量的关联分析

4. 讨论

4.1 鸡PURH 基因单核苷酸多态性

4.2 鸡PURH 基因单核苷酸多态性与肌苷酸含量的关系

第三章肌苷酸合成相关酶基因在白耳鸡不同生长阶段表达规律研究

1. 试验材料

1.1 动物材料

1.2 主要试剂

2. 试验方法

2.1 鸡组织RNA 的提取

2.1.1 提取RNA 的准备工作

2.1.2 Trizol 法提取组织总RNA

2.1.3 RNA 的检测

2.2 反转录

2.3 聚合酶链式反应（PCR）反应

2.3.1 引物的选择和退火温度（Tm）的确定

2.3.2 循环数的确定

2.4 琼脂糖凝胶电泳

2.5 半定量RT-PCR 分析

3. 试验结果

3.1 组织总RNA 的提取

3.2 循环数对目的基因和β-actin 基因表达的影响

3.3 不同生长阶段ADSL 基因表达的变化规律

3.4 不同生长阶段GARS-AIRS-GART 基因表达的变化规律

3.5 不同生长阶段GPAT 基因表达的变化规律

3.6 不同生长阶段AIRC 基因表达的变化规律

3.7 不同生长阶段PURH 基因表达的变化规律

3.8 12 周龄白耳鸡不同组织中各基因的表达规律

3.9 5 个基因在白耳鸡胸肌中表达量的相关分析

4. 讨论

4.1 RT-PCR 方法的构建

4.2 白耳鸡不同生长阶段不同组织中ADSL 基因表达的变化规律

4.3 白耳鸡不同生长阶段不同组织中GARS-AIRS-GART 基因表达的变化规律

4.4 白耳鸡不同生长阶段不同组织中GPAT 基因表达的变化规律

4.5 白耳鸡不同生长阶段不同组织中AIRC 基因表达的变化规律

4.6 白耳鸡不同生长阶段不同组织中PURH 基因表达的变化规律

4.7 5 个基因在胸肌中相对表达量的相关性

第四章肌苷酸合成相关酶基因在白耳鸡群体中多基因聚合效应初探

1. 材料与方法

1.1 试验动物

1.2 主要溶液的配制及主要实验仪器

1.3 引物序列

1.4 试验方法

2. 相关软件及统计方法

2.1 相关软件

2.2 统计方法

3. 结果与分析

3.1 12 周龄白耳鸡胸肌中肌苷酸含量

3.2 各候选基因在白耳鸡群体中的基因频率及基因型频率

3.3 5 个候选基因各基因型对白耳鸡胸肌肌苷酸含量的单基因效应分析

3.4 5 个候选基因合并基因型对白耳鸡胸肌肌苷酸含量两基因效应分析

3.5 5 个候选基因合并基因型对白耳鸡胸肌肌苷酸含量的三基因效应分析

3.6 5 个候选基因合并基因型对白耳鸡胸肌肌苷酸含量的四基因效应分析

3.7 5 个候选基因合并基因型对白耳鸡胸肌肌苷酸含量的五基因效应分析

4. 讨论

4.1 白耳鸡胸肌中肌苷酸含量

4.2 5 个候选基因对白耳鸡胸肌肌苷酸含量的单基因效应

4.3 5 个候选基因合并基因型对白耳鸡胸肌肌苷酸含量的基因效应

全文结论

1. GPAT 基因外显子 2 的变异对鸡肉肌苷酸含量有显著影响

2. AIRC 基因外显子 3 和外显子 8 的变异对鸡肉肌苷酸含量有显著影响

3. GPAT/AIRC 基因启动子区的变异对鸡肉肌苷酸含量有显著影响

4. PURH 基因外显子 16 的变异对鸡肉肌苷酸含量有显著的影响

5. 在白耳鸡群体不同生长阶段不同组织中均检测到 5 个候选基因的表达,大多数基因的表达量呈时序性变化,并且不同基因的表达量之间存在一定的正相关

6. 多基因聚合后合并基因型对白耳鸡胸肌肌苷酸含量影响效果显著,合并的位点越多,效应越大

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