中国野生华东葡萄霜霉病菌接种的SSH文库构建及EST序列分析

论文摘要

葡萄霜霉病[Plasmopara viticola（Berk and Curtis）Bert.and de Toni]是一种世界性的古老病害,也是影响葡萄生产的重要病害之一。育种实践证明,培育抗病品种是控制葡萄霜霉病的有效途径之一。原产我国的葡萄属野生种华东葡萄（Vitis psendoreticulata）“白河-35-1”株系,对葡萄霜霉病表现出很高的抗性。利用其进行抗霜霉病相关基因克隆研究,不仅有利于阐明葡萄的抗病机制,而且对葡萄抗霜霉病的研究及抗病基因的育种利用具有重要价值。本研究以抑制消减杂交技术（SSH）构建文库为基础,以测序为主线,结合生物信息学方法对获得的EST序列进行结构和表达分析,本研究以中国野生华东葡萄白河-35-1株系为材料,用喷雾法人工接种葡萄霜霉菌,取接种后1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d接种的叶片,分别提取RNA,然后等量混合,作为处理,在接种同时取田间自然生长的未接种幼嫩叶片,提取RNA作为对照,用抑制消减杂交技术构建葡萄抗霜霉病基因的消减正反交两个文库。用抗生素、蓝白斑和菌落PCR等方法进行克隆阳性筛选,并对有效序列进行测序,生物信息学分析。菌落PCR显示插入片断在150-900 bp之间,文库质量良好,筛选文库并得到85个正交库有效的EST序列,29条反交库有效EST序列,已全部登录GenBank数据库,登录号分别为:正交库:FG106789 FG106790 FG106791 FG106792 FG106793 FG106794 FG106795FG106796 FG106797 FG106798 FG106799 FG106800 FG106801 FG106802FG106803 FG106804 FG106805 FG106806 FG106807 FG106808 FG106809FG106810 FG106811 FG106812 FG106813 FG106814 FG106815 FG106816FG106817 FG106818 FG106819 FG106820 FG106821 FG106822 FG106823FG106824 FG106825 FG106826 FG106827 FG106828 FG106829 FG106830FG106831 FG106832 FG106833 FG106834 FG106835 FG106836 FG106837FG106838 FG106839 FG106840 FG106841 FG106842 FG106843 FG106844FG106845 FG106846 FG106847 FG106848 FG106849 FG106850 FG106851FG106852 FG106853 FG106854 FG106855 FG106856 FG106857 FG106858FG106859 FG106860 FG106861 FG106862 FG106863 FG106864 FG106865FG106866 FG106867 FG106868 FG106869 FG106870 FG106871 FG106872FG106873反交库:FG106874 FG106875 FG106876 FG106877 FG106878 FG106879 FG106880FG106881 FG106882 FG106883 FG106884 FG106885 FG106886 FG106887FG106888 FG106889 FG106890 FG106891 FG106892 FG106893 FG106894FG106895 FG106896 FG106897 FG106898 FG106899 FG106900 FG106901FG106902利用BLASTn和BLASTx程序将获得的114条EST序列与GenBank的nr数据库进行同源性分析,并将两种比较结果进行汇总获得的结果如下:其中有78个EST序列与GenBank中其他植物相关基因序列有较高的同源性,另有31个EST序列为功能未知序列,它们分别是:FG106797 FG106801 FG106802 FG106803 FG106805FG106806 FG106807 FG106813 FGl06814 FG106816 FG106817 FG106820FG106822 FG106823 FG106824 FG106825 FG106827 FG106837 FG106838FG106841 FG106860 FG106861 FG106864 FG106865 FG106866 FG106868FG106869 FG106871 FG106873 FG106880 FG106894获得的这些序列初步分析共分为:信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等几类,其中获得与抗病直接相关的EST序列22个。这些抗病相关EST序列的功能包括:与抗氧化防御相关的基因如细胞色素P450单加氧酶、谷胱甘肽代谢的关键酶—谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）;信号传导基因如γ-氨基丁酸解氨酶;蛋白质代谢相关泛素结合蛋白、泛素结合酶;受体激酶等。为进一步研究中国野生葡萄抗霜霉病基因全长序列提供了依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物抗病性研究进展
• 1.1.1 植物抗病性的表现
• 1.2 植物的抗病机制
• 1.2.1 植物抗病基因
• 1.2.1.1 植物抗病基因的类型
• 1.2.1.2 植物抗病基因的结构与功能
• 1.2.1.3 抗病基因的起源与进化
• 1.2.2 植物防卫基因
• 1.2.2.1.植物防卫基因的主要类型
• 1.2.2.2 植物防卫基因的组织结构
• 1.2.2.3 植物防卫基因的表达调控
• 1.3 抑制消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization SSH）
• 1.3.1 SSH技术的操作流程
• 1.3.2 SSH技术的特点
• 1.3.3 SSH技术在植物基因分离上的应用
• 1.4 葡萄霜霉病
• 1.4.1 葡萄霜霉病的起源及分布
• 1.4.2 葡萄霜霉病菌
• 1.4.2.1 葡萄霜霉病菌分类及形态特征
• 1.4.2.2 葡萄霜霉病生物学及流行学
• 1.4.3 影响霜霉病流行发展的因素
• 1.4.3.1 感病寄主
• 1.4.3.2 病原物
• 1.4.3.3 环境条件
• 1.4.4 葡萄属植物对霜霉病的抗性
• 1.4.4.1 结构抗病性
• 1.4.4.2 化学抗病性
• 1.4.5 葡萄抗霜霉病遗传
• 1.4.6 葡萄属植物抗霜霉病的分子生物学研究
• 1.5 本研究的目的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 葡萄材料
• 2.1.2 葡萄霜霉菌
• 2.1.3 生化试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 葡萄霜霉菌的收集和菌液的制备及菌孢子的观察、接种方法
• 2.2.1.1 葡萄霜霉菌的收集和菌液的制备
• 2.2.1.2 葡萄霜霉菌菌孢子的观察和培养
• 2.2.1.3.葡萄霜霉菌的接种方法
• 2.2.2 实验用葡萄叶片材料的采集和保存
• 2.2.3 葡萄叶片RNA的提取、纯化和mRNA的分离
• 2.2.3.1 葡萄叶片RNA的提取
• 2.2.3.2 RNA的纯化
• 2.2.3.3 mRNA的分离
• 2.2.3.4 mRNA分离液的浓缩
• 2.2.4 反转录（第一、第二链的合成）及酶切
• 2.2.4.1 反转录
• 2.2.4.2 RsaI酶切
• 2.2.5 接头连接和消减杂交
• 2.2.5.1 接头连接
• 2.2.5.2 消减杂交
• 2.2.5.3 PCR扩增
• 2.2.5.4 PCR产物纯化
• 2.2.6 消减文库的建立、阳性克隆的筛选
• 2.2.6.1 纯化产物与载体的连接
• 2.2.6.2 转化反应
• 2.2.6.3 阳性克隆的获得
• 2.2.7 质粒提取
• 2.2.8 测序
• 2.2.8.1 DNA测序的实验操作
• 2.2.8..2 上机测序
• 第三章 结果与分析
• 3.1 霜霉菌菌孢子的收集和接种
• 3.2 总RNA的提取和mRNA的分离
• 3.3 cDNA合成以及cDNA酶切效果分析
• 3.4 消减PCR结果
• 3.5 PCR产物纯化
• 3.6 抑制消减文库的建立和阳性克隆的筛选
• 3.6.1 连接和转化效率
• 3.6.2 阳性克隆的筛选
• 3.7 消减文库的分析
• 3.8 BLAST的分析结果
• 第四章 讨论
• 4.1 葡萄抗霜霉病基因抑制消减文库EST序列的获得
• 4.1.1 RNA样本的制备
• 4.1.2 抑制消减杂交后PCR产物的纯化
• 4.1.2.1 胶回收法
• 4.1.2.2 试剂纯化法
• 4.1.3 阳性克隆的鉴定
• 4.2 EST序列分析
• 4.3 关于抗病基因的克隆和抑制消减杂交技术
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附表
• 英文缩略词
• 致谢
• 作者简介