论文摘要
研究背景与目的:1971年,哈佛大学Folkman教授提出“实体瘤生长和转移依赖于新生血管生成”观点以来,大量后期实验研究已从分子和基因水平充分证实了这一观点。血管内皮细胞的增殖、侵袭、迁移和分化是新生血管形成过程中的关键环节。因此,抑制内皮细胞的增殖、迁移,以及诱导其凋亡是抗血管生成有效的靶点。目前抗血管生成疗法已经成为治疗肿瘤的新策略。2002年,Jeong等从海洋苔藓虫Watersipora subtorquata中分离得到噻吩环系结构的苔藓蒽噻吩（bryoanthrathiophene）,证实其具有明显抑制BAEC体外增殖及血管生成的作用。使苔藓蒽噻吩类化合物可望成为具有全新结构的抗肿瘤药物。为研究理化性质和构效关系,第三军医大学药物化学教研室周向东教授等以1,8-二羟基-9,10-蒽醌为原料创新性地设计合成了苔藓蒽噻吩类似物—DBT。但其是否具有抑制血管生成活性的研究还未进行。鉴于DBT的合成经济、高效并具有产业化前景,本研究旨在通过一系列体外实验探讨DBT对HUVECs、A549体外增殖的影响,以及对HUVECs血管生成的作用。方法:1.应用MTT法观察不同浓度DBT处理的HUVECs、A549在24h,48h,72h体外增殖的影响。2.应用平板划痕法观察不同浓度DBT处理12h,24h后HUVECs迁移的影响。3.应用管腔形成实验观察不同浓度DBT处理24h后HUVECs血管形成的影响。4.应用Annexin V-PI双染色法,流式细胞仪分析不同浓度DBT处理48 h后HUVECs生长周期及凋亡的影响。结果:1.DBT对HUVECs体外增殖的影响:MTT结果显示在0.16μM0.48μM范围内,加入DBT 24h后,HUVECs的体外增殖受到明显抑制,并且随着DBT浓度的增高,作用时间延长,其抑制作用明显增强,呈明显的时间、剂量依赖性。72h IC50为0.15μM。DBT对A549细胞体外增殖的影响:MTT结果显示低浓度DBT（0.16μM）在作用24h,48h,抑制效果不明显,甚至轻微促进人肺腺癌细胞A549生长,但作用72h能明显抑制A549细胞体外增殖。较高浓度的DBT在作用24 h后即可明显抑制其体外增殖。24h IC50为0.36μM,48h IC50为0.33μM,72h IC50为0.15μM,呈明显时间、剂量依赖性。2.不同浓度DBT处理12,24h后HUVECs迁移的影响:平板划痕法结果显示0.32μmol/L DBT作用HUVECs 12h相对于对照组抑制率约为37.93%;当浓度达到0.48μM时,作用12h后相比于对照组划痕间距更加明显,抑制率达到79.07%（P<0.01）。3.不同浓度DBT作用24h后,与空白组相比,0.04μM、0.20μM、0.40μM实验组及含有0.02μM endostar的阳性对照组HUVECs构建形成的管腔样网状结构明显减少。与空白对照组比较,Endostar组管腔形成抑制率达到92.66%（P<0.01）;0.04μM对HUVECs管腔形成抑制率为56.66%（P<0.01）;当DBT浓度为0.20μM时,管腔形成抑制率达到82.46%（P<0.01）;在0.40μM时,抑制率达97.23%（P<0.01）。4.用流式细胞仪分析不同浓度DBT处理HUVECs 48h后的细胞周期变化情况,发现随着DBT的作用浓度提高,G0/G1期细胞比例明显上升,细胞较多的阻滞于该期,而S期、G2/M期细胞所占比例逐渐下降, HUVECs细胞的增殖受到抑制。不同浓度的DBT处理HUVECs细胞48h后,流式细胞仪检测细胞凋亡显示,HUVECs的凋亡率随着DBT浓度的增加而升高,细胞的凋亡比例分别从5.9%上升至27.46%,45.58%,59.54%。结论:1.MTT法分析发现,DBT能明显抑制HUVECs、的体外增殖,HUVECs在DBT作用72h的IC50为0.15μM, A549细胞分别在DBT 24h,48h,72h的IC50为0.36μM、0.33μM、0.30μM,对HUVECs、A549细胞体外增殖的抑制作用呈剂量和时间依赖性。2.平板划痕法观察不同浓度DBT处理12,24h后HUVECs迁移发现随着DBT浓度的升高,作用时间延长,相对于对照组划痕间距越发明显。提示DBT在血管生成过程中的内皮细胞迁移阶段也起着明显抑制作用。3.体外管腔形成实验研究了DBT对HUVECs官腔形成的影响。同时采用目前公认的抗血管生成抑制剂Endostar作为阳性对照,发现低浓度的DBT 0.04μM,作用24h,HUVECs构建形成的管腔样网状结构明显减少,当DBT浓度达到0.40μM,发现与Endostar 0.02μM对小管形成影响效果相近,Endostar在0.02μM对体外管腔形成抑制作用最为明显。4.通过流式细胞仪分析不同浓度DBT处理48h后,发现HUVECs细胞周期变化情况,G0/G1期细胞比例明显上升,而S期、G2/M期细胞所占比例逐渐下降;HUVECs的凋亡率随着DBT浓度的增加而升高。提示DBT能体外促进HUVECs凋亡。以上研究提示,DBT可抑制HUVECs、A549细胞体外增殖,促进HUVECs的凋亡,同时通过抑制HUVECs体外迁移、体外管腔形成,而具有显著体外抗血管生成作用。
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标签：去甲苔藓蒽噻吩论文; 血管生成论文; 人脐静脉内皮细胞论文; 人肺腺癌细胞系细胞论文;