论文摘要
微卫星DNA是理想分子标记之一,广泛地应用于食品跟踪、群体遗传多样性等领域。中华绒螯蟹是绒螯蟹属中最具经济价值品种,为我国重要水产养殖和遗传保护对象。有关中华绒螯蟹遗传标记研究较薄弱,处于起步阶段,对于个体鉴定和跟踪还有较远距离。本研究首次采用磁珠富集法构建中华绒螯蟹微卫星文库,分离微卫星;在此基础上,采用荧光标记和毛细管电泳技术,分析微卫星特征并构建复合PCR高效扩增系统;应用所得标记,分析中华绒螯蟹的群体遗传多样性和个体识别;本研究还采用实时PCR技术首次报道中华绒螯蟹的基因组大小。1.中华绒螯蟹微卫星DNA文库的构建中华绒螯蟹微卫星的单富集文库主要构建过程有高分子量基因组DNA经Rsal消化、连接接头、PCR扩增、变性、Dynabeads?磁珠杂交和捕获、转化、克隆PCR、测序及序列分析等过程。为提高效率,对磁珠一次杂交后捕获的回收片段再次富集,构建双富集文库。测序结果表明,磁珠富集法比传统文库筛选法的微卫星分离效率高一个数量级,双富集文库中78.1%的克隆含有侧翼序列的微卫星。2.中华绒螯蟹微卫星的特征分析基于20个微卫星位点设计PCR引物,其中有14个位点在退火温度55℃、Mg2+的浓度为1.5mM能特异性扩增。采用FAM标记10个位点引物,HEX标记4个位点引物,PCR扩增经AcroprepTM过滤板吸附法快速提取的32个中华绒螯蟹样品基因组DNA。以分子长度标准ROX500为内标,PCR扩增产物经ABI3730XL毛细管电泳检测,Genemapper 3.5分析,结果表明毛细管电泳能精确检测微卫星的多态性。14个位点中ES10和ES26存在基因重复,ES38为单态位点,其它11个多态位点可以用于中华绒螯蟹的群体多样性的研究。3.荧光复合PCR的构建与优化将9个微卫星位点分成两组,5个位点用FAM（蓝色）标记,4个位点用HEX（绿色）标记;两种荧光类型分组优化,用琼脂糖胶电泳检测。随后,荧光标记的复合PCR扩增8个中华绒螯蟹样品的9个微卫星位点,采用毛细管电泳检测,调整各微卫星位点引物比例使所有位点均匀扩增。最后,逐一检测复合PCR基本参数对复合PCR产物的影响,优化PCR条件。结果表明荧光复合PCR的最优参数为dNTP 200μM、36个循环、Ta 55℃45s、退火时间为60s,摸板DNA20-500ng均可以稳定扩增。4.微卫星评估中华绒螯蟹的群体遗传多样性对无锡、苏州和上海的三个中华绒螯蟹群体共计102个样品,采用过滤板AcroprepTM吸附基因组DNA,使用已经特征分析的11个微卫星标记对基因组DNA进行PCR扩增,PCR产物经毛细管电泳检测。位点ES37可能存在无效等位基因,其余10个位点分析统计结果为:平均每个位点有高达22.9个等位基因,PIC和E值分别高达0.826和7.700,这一结果清楚表明中华绒螯蟹群体具有较高的遗传多样性。欧氏遗传距离和遗传相似性平均值分别为0.439和0.825;瓶颈分析表明有必要对中华绒螯蟹采取科学的品种保护计划。5.中华绒螯蟹的个体来源识别初步分析应用GeneClass 2.0软件,比较频率法、贝叶斯法、DAS、标准内氏、最小内氏、内氏DA、Cavalli-Sforza和Goldstein等8种个体来源识别不同算法,结果表明贝叶斯法识别率最高,达93.14%;单一微卫星位点的个体识别分析表明,等位基因数最多的ES35标记个体识别能力最高,达87.25%;选择多态性高的微卫星位点,有助于减少微卫星位点的使用数量,且不降低个体正确识别率。6.实时PCR测定中华绒螯蟹基因组大小以已经测序的水稻样品（Nipponbare）为对照,建立一种实时PCR方法定量检测中华绒螯蟹基因组大小。整个过程约120 min,PCR效率为97.8%。标准曲线为Y=-3.768X+44.568,标准曲线的相关系数（R2）为0.992,结果表明中华绒螯蟹的基因组大小（c值）为1.72±0.25pg。研究不仅首次报道了中华绒螯蟹的基因组大小,还表明基于SYBR GreenI的定量PCR方法可为基因组大小的定量检测提供了一种特异、快速和简洁的方法。
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摘要ABSTRACT第一章 绪论1.1 前言1.2 分子遗传标记简介1.2.1 线粒体DNA1.2.2 限制性片段多态性1.2.3 随机扩增多态DNA1.2.4 扩增长度多态1.2.5 表达序列标记1.2.6 单核苷酸多态性1.3 微卫星DNA及其特点1.3.1 微卫星DNA数量多且在基因组中分布均匀1.3.2 微卫星DAN具有特异性1.3.3 微卫星DNA具有多态性1.3.4 微卫星DNA容易检测1.4 微卫星标记的应用1.4.1 食品跟踪与鉴定1.4.2 评估遗传多态性1.4.3 构建基因组连锁图1.4.4 功能基因定位及QTL分析1.4.5 用于标记辅助选择1.5 微卫星标记的分离1.6 微卫星的检测1.7 中华绒螯蟹生物标记及其应用1.8 本课题立题意义和主要研究内容第二章 中华绒螯蟹微卫星文库构建2.1 前言2.2 材料与方法2.2.1 实验材料与主要试剂2.2.2 主要仪器2.2.3 实验方法2.2.3.1 中华绒螯蟹样品采集、基因组提取和消化2.2.3.2 接头连接和PCR扩增2.2.3.3 PCR扩增连接产物2.2.3.4 PCR产物纯化2.2.3.5 探针杂交2.2.3.6 磁珠平衡与捕获2.2.3.7 捕获洗脱和浓缩2.2.3.8 PCR扩增2.2.3.9 载体构建和转化2.2.3.10 克隆PCR2.2.3.11 测序2.2.3.12 文库保存2.2.3.13 二次富集2.3 结果与讨论2.3.1 中华绒螯蟹基因组和RSA Ⅰ酶消化2.3.2 杂交后磁珠捕捉2.3.3 克隆PCR与测序2.3.4 SEQUENCHER组装微卫星及序列分析2.3.5 微卫星文库评估2.4 本章小结参考文献第三章 中华绒螯蟹微卫星的特征分析3.1 前言3.2 材料与方法3.2.1 实验材料与主要试剂3.2.2 主要仪器3.2.3 实验方法3.2.3.1 中华绒螯蟹样品采集和基因组提取3.2.3.2 引物设计与优化3.2.3.3 荧光标记和PCR扩增3.2.3.4 毛细管电泳检测3.2.3.5 用Genemapper 3.5软件分析产物长度3.2.3.6 数据统计与分析3.3 结果与讨论3.3.1 中华绒螯蟹基因组提取3.3.2 引物设计和优化3.3.3 毛细管电泳3.3.4 基因重复位点3.3.4 微卫星位点多态性3.3.5 微卫星位点HARDY-WEINBERG平衡3.4 本章小结参考文献第四章 荧光复合PCR的构建与优化4.1 前言4.2 材料与方法4.2.1 实验材料与主要试剂4.2.2 主要仪器4.2.3 实验方法4.2.3.1 遗传位点选择4.2.3.2 PCR试剂和条件4.2.3.3 模版DNA制备4.2.3.4 引物比例优化4.2.3.5 复合PCR引物比例优化4.2.3.6 复合PCR参数优化4.3 结果与讨论4.3.1 琼脂糖胶电泳优化4.3.2 荧光标记复合PCR4.3.3 复合PCR参数优化参考文献第五章 微卫星评估中华绒螯蟹的群体遗传多样性5.1 前言5.2 材料与方法5.2.1 实验材料与主要试剂5.2.2 主要仪器5.2.3 实验方法5.2.3.1 中华绒螯蟹样品采集5.2.3.2 基因组提取5.2.3.3 微卫星DNA位点和引物5.2.3.4 PCR扩增5.2.3.5 毛细管电泳检测5.2.3.6 数据统计与分析5.3 结果与讨论5.3.1 基因组提取5.3.2 群体遗传多样性5.3.4 遗传分化分析和瓶颈检测5.3.5 微卫星位点多态性5.4 本章小结参考文献第六章 中华绒螯蟹的个体来源识别初步分析6.1 前言6.2 原理与方法6.2.1 原理6.2.1.1 似然法6.2.1.1.1 频率分析法6.2.1.1.2 贝叶斯法6.2.1.2 遗传距离分析6.2.2 样本来源及变量的选择6.3 结果与讨论6.3.1 不同个体识别算法比较6.3.2 不同位点方法比较6.3.3 位点组合方法比较6.4 本章小结参考文献第七章 实时PCR测定中华绒螯蟹基因组大小7.1 前言7.2 材料与方法7.2.1 实验材料与主要试剂7.2.2 主要仪器7.2.3 实验方法7.2.3.1 样品来源7.2.3.2 DNA分离和纯化7.2.3.3 引物与模板7.2.3.4 标准物克隆的制备7.2.3.5 系列标准物稀释7.2.3.6 实时PCR7.3 结果与讨论7.3.1 实时荧光扩增曲线图7.3.2 熔解曲线7.3.3 荧光定量标准曲线7.3.4 中华绒螯蟹基因组大小7.4 本章小结参考文献论文主要结论与创新点致谢攻读博士学位期间发表的学术论文
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