粘红酵母种内原生质体融合选育高产油脂及类胡萝卜素菌株的研究

论文摘要

微生物产油脂是生物柴油的重要来源,本实验室前期筛选到一株高产油脂的红酵母,在高含油脂同时,还含有类胡萝卜素。为了进一步提高该菌株的产油性能,本文对该菌株进行种内融合育种筛选高产油脂菌株,并进一步优化发酵条件。本文首先考察了粘红酵母细胞的原生质体形成、再生最佳组合条件,并进行种内融合构建高产油脂菌株。结果表明粘红酵母原生质体最适制备条件为：培养10h粘红酵母,原生质体形成时用pH值6.0、0.7mol/L NaCl高渗缓冲液,2.0%蜗牛酶和1.0%纤维素酶作为酶解液,摇床转速120 r/min、35℃温育酶解30 min,原生质体再生时用pH值6.0、0.6 mol/L甘露醇柠檬酸高渗缓冲液,粘红酵母原生质体形成率及再生率分别达到83.34%和78.12%。用聚乙二醇诱导粘红酵母原生质体发生种内融合,得到了一株高产油脂及类胡萝卜素的菌株,其油脂含量占细胞干重的68.42%,比亲本提高了7.42%,达到较高水平,而且产类胡萝卜素的能力是亲株的1.65倍,其生物量也比亲株稳定提高了1.04g/L,融合子经传代十代,传代性能稳定,为工业化生产奠定基础,但依然需要通过优化菌株的发酵条件来提高油脂和类胡萝卜素产量。由于发酵条件影响菌株的生长和油脂积累,为进一步提高7号融合菌株的油脂产量,以该菌为出发菌株进行产油脂发酵条件优化,通过单因子实验和正交实验摇瓶发酵确定其最佳产脂发酵条件为：最适碳源为40g/L蔗糖,最适氮源为12g/L酵母膏和3g/L蛋白胨,温度28℃,培养基pH值6.0,接种量5%,摇床转速120r/min,培养时间3天。5L罐发酵结果表明其油脂产量可达11.28g/L(6d),油脂含量占菌体干重的69.18%,比亲本油脂含量增加了8.18%；其生物量达到16.80g/L,比亲本粘红酵母生物量增加了19.00%,比出发菌株生物量增加了10.96%。7号融合菌株在高产油脂的同时,发现其类胡萝卜素的产量也有所提高,由于发酵条件影响菌株生长和类胡萝卜素的积累,因而进一步将其作为出发菌株,通过单因子实验和正交实验摇瓶发酵确定其最佳产类胡萝卜素的发酵条件为：最适碳源为40g/L蔗糖,最适氮源为12g/L酵母膏和3g/L蛋白胨,温度28℃,培养基pH值6.0,接种量30%,摇床转速150r/min,培养时间3天。5L罐发酵7号融合菌株类胡萝卜素产量最大达到8.09mg/L(5d),比出发菌株增加了56.24%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 生物柴油研究概述
• 1.1.1 研究生物柴油的意义
• 1.1.2 国外生物柴油的研究进展
• 1.1.3 国内生物柴油的研究进展
• 1.1.4 生物柴油发展存在的问题
• 1.1.5 产油脂的微生物资源探索
• 1.1.6 酵母菌产油脂的技术探索
• 1.2 类胡萝卜素研究概述
• 1.2.1 研究类胡萝卜素的意义
• 1.2.2 国内外类胡萝卜素研究进展
• 1.2.3 产类胡萝卜素微生物资源探索
• 1.2.4 微生物产类胡萝卜素生物技术探索
• 1.3 本文的研究背景和研究内容
• 第二章 粘红酵母原生质体形成与再生条件优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 酶液的配制
• 2.1.4 高渗缓冲溶液的配制
• 2.1.5 粘红酵母菌种活化与扩大培养
• 2.1.6 粘红酵母原生质体的形成与再生方法
• 2.1.7 粘红酵母原生质体的显微镜检与菌落计数
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同菌龄对粘红酵母原生质体形成和再生的影响
• 2.2.2 酶解时不同温育方式对粘红酵母原生质体形成和再生的影响
• 2.2.3 不同高渗缓冲液对粘红酵母原生质体形成和再生的影响
• 2.2.4 不同细胞壁水解酶对粘红酵母原生质体形成和再生的影响
• 2.2.5 不同pH值对粘红酵母原生质体形成和再生的影响
• 2.2.6 水解酶不同作用温度对粘红酵母原生质体形成和再生的影响
• 2.2.7 水解酶不同作用时间对粘红酵母原生质体形成和再生的影响
• 2.2.8 在最适条件下制备粘红酵母原生质体
• 2.3 结论
• 第三章 粘红酵母种内原生质体融合构建高产油脂菌株
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 酶液的配制
• 3.1.4 高渗缓冲液的配制
• 3.1.5 粘红酵母菌种活化与扩大培养
• 3.1.6 粘红酵母原生质体的制备方法
• 3.1.7 粘红酵母原生质体的显微镜检
• 3.1.8 粘红酵母原生质体种内融合方法
• 3.1.9 融合菌株的形态学鉴定及生理指标分析方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 融合菌株的形态学分析
• 3.2.2 融合菌株油脂种类和含量的测定及其稳定性分析
• 3.2.3 融合菌株类胡萝卜素含量的测定及其稳定性分析
• 3.2.4 融合菌株生物量的测定及其稳定性分析
• 3.2.5 融合菌株DNA含量的测定及其稳定性分析
• 3.3 结论
• 第四章 7号融合菌株产油脂发酵条件优化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 菌体前处理
• 4.1.4 菌体脂肪酸含量及组分分析
• 4.1.5 发酵条件优化单因子实验
• 4.1.6 发酵条件优化正交实验
• 4.1.7 发酵装置
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 发酵条件优化单因子实验
• 4.2.2 发酵条件优化正交实验
• 4.2.3 7号融合菌株在最佳培养条件下产油脂摇瓶发酵代谢过程
• 4.2.4 7号融合菌株5L发酵罐中的油脂积累
• 4.3 结论
• 第五章 7号融合菌株产类胡萝卜素发酵条件优化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌种
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 菌体前处理
• 5.1.4 菌体类胡萝卜素含量测定
• 5.1.5 发酵条件优化单因子实验
• 5.1.6 发酵条件优化正交实验
• 5.1.7 发酵装置
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 发酵条件优化单因子实验
• 5.2.2 发酵条件优化正交实验
• 5.2.3 7号融合菌株在最佳培养条件下产类胡萝卜素摇瓶发酵代谢过程
• 5.2.4 7号融合菌株5L发酵罐中的类胡萝卜素积累
• 5.3 结论
• 小结
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢