低强度脉冲超声波促人牙周膜成纤维细胞增殖效应表达的初步研究

论文摘要

牙周病、不当口腔临床治疗、外伤等均可造成牙周组织损伤、破坏。随着口腔保健意识及功能、美观等要求的提高,患者希望尽可能保留牙齿。因此,获得牙周组织的再生性修复十分必要,其生物学基础依赖于牙周膜细胞（Periodontal Ligament Cells, PDLCs）的有效增殖[1]。牙周膜（periodontal ligament,PDL）是牙根与牙槽骨之间的一薄层结缔组织,由处于不同增殖阶段或具不定向分化趋势的多细胞亚群构成,在外界刺激下可定向增殖、分化,从而实现牙周组织的再生性修复[2,3,4]。成纤维细胞是人牙周膜细胞（human Periodontal Ligament Cells, HPDLCs）的优势亚群之一,具有较强的增殖能力、多向分化潜能等干细胞的某些特性,在牙周组织的再生性修复中发挥着重要作用[5]。以往研究多探讨细胞因子[6]、中药[7]、物理[8]、化学物质[9]等因素作用下人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblasts , HPDLF）增殖、分化的改变及其机理,以期达到对其定向调控并促进牙周组织再生。但尚未发现一种经济、安全、有效的促进HPDLF增殖效应表达的途径。近年来,低强度脉冲超声波（Low Intensity Pulsed Ultrasound,LIPUS）在无创促进骨创伤修复的作用已得到临床认可和应用[10];亦有研究发现其生物、物理学效应可促进某些细胞的增殖、分化[11,12]。因此,LIPUS对HPDLF增殖效应表达的影响具有极高研究价值和潜在应用前景。本研究采用组织块法培养了HPDLCs,并进一步纯化构建了HPDLF的体外纯化培养模型。在该模型基础的细胞组织学来源鉴定证实其为中胚层来源;采用MTT法绘制了不同接种密度（1*104、2*104、1*103）的细胞生长曲线,发现HPDLF的适宜接种密为1*104度;结合细胞形态、生长趋势观察等证实本研究构建的HPDLF体外培养系性状稳定、活性良好。在前述成果基础上,构建了“HPDLF--LIPUS辐照模型”,经MTT法、考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue,CBB）染色法等定量、半定量检测方法比较了不同参数（声强:30MW、60MW、90MW,作用时间:10min、20min、30min,重复频率1KHz,脉冲频率1.5MHz）的LIPUS辐照对HPDLF的增殖活性、胞内总蛋白表达量的影响,初步探讨了LIPUS辐照对HPDLF增殖效应表达的影响。遴选适宜本实验条件下促进HPDLF增殖效应表达的LIPUS辐照参数。本研究发现所构建的LIPUS辐照模型具有操作简便,成本低、可有效控制细胞污染等优势,并保证了超声辐照的稳定性、有效性。MTT生长曲线及CBB蛋白测定结果均显示LIPUS辐照对HPDLF的增殖效应表达有促进效应,且90mw,20min/天（重复频率1KHz,脉冲频率1.5MHz）的辐照参数效应最显著。但最长辐照时间（30min）组和最大声强组（90mw）中均未发现抑制效应,并且90mw,20min/天辐照下细胞生长曲线和蛋白浓度变化发现具有近似变化趋势,表明LIPUS对HPDLF的促增殖效应不仅是细胞数量增加的促分裂效应,也同时提高细胞的功能活性。这提示采用LIPUS辐照法有助于获得具有较高功能活性的HPDLF种子细胞。基于前述最适宜参数,本研究进一步结合流式细胞术、RT-PCR法检测了LIPUS辐照下HPDLF的细胞周期及碱性成纤维细胞生长因子（Fibroblast Growth Factor,bFGF）、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）的表达水平。本研究显示受LIPUS辐照6h、12h时,HPDLF均显著表达bFGF,且12h表达量高于6h,差异有统计学意义（P<0.05）,推测HPDLF在受LIPUS辐照后12h内对bFGF的表达有随时间延长而上调的趋势。但是,尚未见TGF -β1的显著表达,可能系HPDLF受LIPUS辐照12h内所表达细胞因子如bFGF等间接抑制了其对TGF -β1的表达,或TGF -β1的表达发生在HPDLF受LIPUS辐照12h后。此外,细胞周期检测结果显示LIPUS辐照后HPDLF的增殖指数（proliferation index,PrI）较对照组显著提高,具有与对照组一致的周期性波动。这可能与HPDLF固有细胞周期循环相关,提示LIPUS对HPDLF促增殖效应表达的机制之一为提高HPDLF的PrI,但不能通过改变HPDLF固有细胞周期时间的方式加快细胞增殖速度。综上所述,LIPUS辐照可促进HPDLF的增殖效应表达,且基于本研究构建“HPDLF--LIPUS辐照模型”的较适宜辐照参数为声强90MW,辐照时间20min/d,重复频率1KHz,脉冲频率1.5MHz。本研究证实LIPUS辐照可提高HPDLF的PrI,从而促进其增殖效应的表达,但不能改变其固有细胞周期时间。同时,发现LIPUS辐照可促进HPDLF对特定细胞因子的表达。上述结果提示90mw,20min/天的LIPUS辐照有助于获得牙周组织工程相关的功能活性HPDLF种子细胞。

论文目录

• 符号说明
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 HPDLF 的纯化培养及“HPDLF--LIPUS 辐照模型”的构建
• 实验一 HPDLF 的纯化培养及组织学来源鉴定
• 1 材料与设备（表1-3）
• 2 实验方法
• 3 HPDLF 的组织学来源鉴定及生物学特性探讨
• 4 结果
• 5 结果分析
• 6 讨论
• 7 结论
• 实验二“HPDLF--LIPUS 辐照模型”的构建
• 1 设备与材料
• 2 辐照方式
• 3 结果
• 4 结论
• 第二部分 LIPUS 辐照对HPDLF 增殖效应的影响
• 实验一 不同时间、强度LIPUS 辐照下HPDLF 增殖曲线绘制
• 1 实验分组（表6）
• 2 材料与方法
• 3 结果及结果分析
• 4 讨论
• 5 结论
• 实验二 LIPUS 辐照对HPDLF 胞内总蛋白表达的影响
• 1 试验分组（表7）
• 2 主要试剂
• 3 实验方法
• 4 结果（表8-表13）
• 5 结果分析（图26-32）
• 6 讨论
• 7 结论
• 第三部分 LIPUS 辐照对HPDLF 细胞周期的影响
• 1 材料与方法
• 2 实验结果
• 3 结果分析（表16）
• 4 讨论
• 5 结论
• 第四部分 LIPUS 辐照对HPDLF 表达TGF-Β1、BFGF 的影响
• 1 材料与方法
• 2 实验结果
• 3 结果分析（表18）
• 4 讨论
• 5 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 附图
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况
• 攻读学位期间参与的科研项目