降胆固醇乳酸菌的筛选及高密度培养

论文摘要

作为益生菌,乳酸菌具有抑制噬菌体生长、抑制结肠癌、增强机体免疫力和降低血清胆固醇等功能。随着对乳酸菌降低胆固醇机理研究的深入,越来越多的研究者开始支持Frand A.M提出的共沉淀理论。Frand认为乳酸菌对胆固醇的降解是由于胆盐在酸性条件下与胆固醇形成沉淀,而促进胆盐水解的酶就是胆盐水解酶（BSH）,胆盐水解酶活力的大小决定了胆酸的生成量,同时在一定程度上决定了降胆固醇的能力大小。本实验通过微生物技术和分子生物学技术实验相结合的方法筛选出具有降胆固醇能力,产胆盐水解酶的乳酸菌株。通过选择性培养,从发酵食品中初步筛选出乳酸菌Lp-1。对实验室初步筛选的乳酸菌菌株Lp-1采用牛津杯法,进行体外降胆固醇实验,应用PCR方法鉴定菌株中的胆盐水解酶基因,应用16S rRNA方法鉴定该菌株。结果显示乳酸菌菌株Lp-1具有体外降胆固醇功能,基因组中含有胆盐水解酶基因,其DNA序列与已发表的胆盐水解酶基因的同源性为98.9%；该菌株与已发表的植物乳杆菌16SrRNA同源性为99%。依上可以证实：筛选到一株植物乳杆菌Lp-1（Lactobacillius plantarum Lp-1）,该菌含有胆盐水解酶基因,并产胆盐水解酶。通过单因素实验,选择出对乳酸菌Lp-1细胞生长和胆盐水解酶酶活影响较为显著的5个因素（碳源、氮源、温度、接种量及pH）,通过Box-Behnken设计对影响较为显著的因素进行响应面的优化实验。得出优化后的培养条件为：葡萄糖27.77g,酵母浸提物10.77g,水解乳蛋白8.95g,胰蛋白胨6.93g,温度35.62℃,pH6.5,接种量5.92%。在5L发酵罐中,通过pH控制和流加葡萄糖对乳酸菌Lp-1进行高密度培养。通过研究不同的中和剂对细胞生长的影响及消耗体积的比较,选择2M NaOH为发酵过程中的中和剂。通过对细胞培养过程中还原糖含量变化及不同碳氮比对细胞生长影响的研究,确定补料添加50g/L葡萄糖溶液,流加速度为1mL/min。通过对植物乳杆菌Lp-1（Lactobacillius plantarum Lp-1）进行高密度培养,菌体浓度达到了1.66×1010cfu/mL,是高密度培养前的1.8倍；另外,胆盐水解酶酶活也与未控制pH时相比提高78.1%,酶活到达了19.6IU/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 乳酸菌的研究
• 1.1.1 益生菌定义
• 1.1.2 益生菌的功能
• 1.2 乳酸菌培养研究进展
• 1.2.1 菌种筛选
• 1.2.2 高密度培养
• 1.3 乳酸菌研究热点
• 1.4 题目的与意义
• 第二章 降胆固醇乳酸菌的分离与鉴定
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 实验结果与讨论
• 2.2.1 菌种的分离纯化
• 2.2.2 细菌基因组提取
• 2.2.3 胆盐水解酶基因鉴定
• 2.2.4 利用Biolog板进行菌种鉴定
• 2.2.5 16S rRNA鉴定
• 2.3 小结
• 第三章 降胆固醇乳酸菌培养条件的优化
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 实验结果与讨论
• 3.2.1 单因素实验
• 3.2.2 Box-Behnken实验
• 3.3 小结
• 第四章 降胆固醇乳酸菌高密度培养
• 4.1 实验材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 实验材料与方法
• 4.2.1 生长曲线测定
• 4.2.2 中和剂的选择
• 4.2.3 物料浓度的选择
• 4.2.4 高密度培养
• 4.3 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介