共刺激分子B7-H1在膀胱癌免疫逃逸和免疫治疗中的作用研究

论文摘要

在肿瘤发生发展的过程中，肿瘤细胞和机体的免疫系统相互影响，相互制约。肿瘤细胞可以通过多种途径逃避机体的免疫监视作用而使自身得以繁衍和发展，即发生肿瘤的免疫逃逸现象。对肿瘤免疫逃逸机制的研究一直是攻克肿瘤道路上的一个热点和难点。T细胞介导的细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要形式之一，肿瘤免疫应答的产生需要免疫系统有效识别和提呈肿瘤抗原，并活化特异性T细胞从而产生免疫杀伤作用。而肿瘤细胞往往可以通过异常表达和（或）缺如某些免疫分子，使特异性T细胞处于无反应或免疫耐受状态，甚至导致T细胞凋亡，从而逃避机体的免疫杀伤作用。B7-H1是一种最近新发现的抑制性共刺激分子，其与受体结合后可以提供抑制性信号从而诱导T细胞凋亡，抑制T细胞的活化和增殖，是近年来发现与肿瘤免疫逃逸有关的重要分子之一。目前研究已发现B7-H1在人肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、肾细胞癌等多种肿瘤组织表面都有大量表达，并且与肿瘤的发生发展、浸润转移等生物学行为密切相关。膀胱癌是我国泌尿外科最常见的恶性肿瘤，其治疗后的高复发率及其恶性进展的生物学行为均提示在膀胱癌中还存在着某些机制使膀胱癌细胞能够逃避机体免疫细胞的杀伤作用，逃避机体的抗肿瘤免疫而继续生长。B7-H1因其在T细胞活化和肿瘤免疫逃逸中的重要作用，已成为目前国内外肿瘤学研究领域的焦点之一。但是B7-H1在膀胱癌中的表达情况如何，特别是B7-H1是否在膀胱癌免疫逃逸机制中发挥作用，以及干预B7-H1信号能否成为膀胱癌免疫治疗的新策略，目前国内外研究较少，鲜有报道。因此，本研究旨在通过检测B7-H1在膀胱癌中的表达情况，并在体外检测B7-H1过表达对肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicity lymphocyte，CTL）抗膀胱癌免疫效应的影响，进而探讨其在膀胱癌免疫逃逸中的作用。在此基础上，通过B7-H1阻断型抗体阻断B7-H1的表达，检测B7-H1阻断对肿瘤特异性CTL及两种新型过继免疫细胞（CD3AK细胞和CD3／CD28共刺激活化T细胞）抗膀胱癌免疫效应的影响，进而探讨B7-H1阻断在膀胱癌免疫治疗中的作用，以期为膀胱癌的免疫治疗提供新的策略。第一部分膀胱癌组织中B7-H1的表达及其临床意义目的：检测B7-H1 mRNA及蛋白在膀胱癌组织中的表达情况，并探讨B7-H1的表达与膀胱癌发生发展的关系及其临床意义。方法：采用RT-PCR方法检测B7-H1基因mRNA在膀胱癌组织中的表达情况，采用免疫组化法检测B7-H1蛋白及FasL蛋白在膀胱癌组织中的表达情况，并分析B7-H1的表达与膀胱癌各生物学指标及FasL表达的相关性，同时随访膀胱癌患者术后生存情况，将B7-H1的表达与患者术后生存时间进行生存分析。结果：B7-H1 mRNA和蛋白在正常膀胱组织中均无表达，而在膀胱癌组织中表达明显增加，并且B7-H1的表达水平与膀胱癌的病理分级、临床分期等生物学指标密切相关。高分级组及浸润型组B7-H1 mRNA和蛋白的表达水平分别明显高于低分级组和浅表型组，复发组B7-H1蛋白的表达水平明显高于初发组。同时，膀胱癌组织中B7-H1蛋白的表达与FasL蛋白的表达显著相关。另外，B7-H1蛋白的表达与膀胱癌患者的预后具有明显相关性，B7-H1阳性表达的患者其术后生存率明显低于B7-H1阴性表达的患者，相关因素多变量分析发现B7-H1蛋白的表达可以作为膀胱癌的独立预后指标之一。结论：B7-H1在膀胱癌中存在着过表达，并且其表达与膀胱癌的发生发展及预后密切相关，可以作为评价膀胱癌生物学行为的参考指标。B7-H1与其受体结合后可能通过上调FasL的表达，触发特异性T细胞发生凋亡，从而介导膀胱癌细胞逃避机体的免疫监视作用。第二部分膀胱癌细胞系BIU-87中B7-H1的表达及LPS对其表达的诱导作用目的：检测B7-H1在膀胱癌细胞系BIU-87中的表达情况以及LPS对其表达的诱导作用，同时通过LPS诱导形成高表达B7-H1的BIU-87细胞，从而为下一步实验研究做准备。方法：采用RT-PCR方法和Western blot方法分别检测B7-H1 mRNA和蛋白在BIU-87细胞中的表达情况，随即给予不同浓度的LPS进行诱导，进而采用RT-PCR方法和Western blot方法分别检测诱导后B7-H1 mRNA和蛋白的表达情况。结果：体外常规培养未经诱导的BIU-87细胞上有B7-H1 mRNA和蛋白的组成性表达，但表达量均较低。经不同浓度LPS（0．5-2μg／mL）体外诱导后，BIU-87细胞上B7-H1 mRNA和蛋白的表达量显著增加，并且随着LPS浓度的增加，B7-H1mRNA和蛋白的表达量亦呈升高趋势，其中当LPS浓度为1μg／mL时，B7-H1mRNA和蛋白的表达量到达高峰。结论：膀胱癌BIU-87细胞上有B7-H1 mRNA和蛋白的组成性表达，但表达量较低，经LPS诱导后B7-H1 mRNA和蛋白的表达均显著增加。这表明可以通过LPS诱导形成高表达B7-H1的BIU-87细胞，进而模拟体内B7-H1高表达的膀胱癌局部微环境。第三部分B7-H1参与膀胱癌细胞免疫逃逸的体外实验研究及其干预性治疗目的：探讨B7-H1在膀胱癌细胞免疫逃逸中的作用以及干预B7-H1信号对肿瘤抗原特异性CTL抗膀胱癌免疫效应的影响。方法：利用LPS体外诱导形成高表达B7-H1的膀胱癌BIU-87细胞，以模拟膀胱癌患者体内高表达B7-H1的肿瘤微环境。分离健康人外周血T细胞，以丝裂霉素灭活的BIU-87细胞为刺激细胞，激活形成肿瘤抗原特异性CTL。将高表达B7-H1的BIU-87细胞及对照组BIU-87细胞与肿瘤抗原特异性CTL混合培养，MTT法检测肿瘤抗原特异性CTL对BIU-87细胞的杀伤活性，PI染色流式细胞术检测肿瘤抗原特异性CTL自身的凋亡率。然后利用B7-H1单克隆抗体阻断BIU-87细胞表面B7-H1的表达，MTT法和流式细胞术分别检测其对肿瘤抗原特异性CTL抗膀胱癌活性和自身凋亡率的影响。结果：肿瘤抗原特异性CTL对高表达B7-H1的BIU-87细胞的杀伤活性与对照组相比明显降低，而其自身的凋亡率却明显增加，体外存活时间亦明显缩短。B7-H1表达被阻断后，肿瘤抗原特异性CTL对BIU-87细胞的杀伤活性明显增强，其自身凋亡率亦明显降低，并且呈剂量依赖性。结论：膀胱癌细胞可以通过表达B7-H1诱导肿瘤特异性CTL凋亡从而逃避肿瘤特异性CTL的杀伤作用，B7-H1可能在膀胱癌的发生发展及免疫逃逸机制中发挥重要的作用，干预B7-H1信号将有望成为膀胱癌免疫治疗的新策略。第四部分B7-H1阻断对CD3AK细胞及CD3／CD28共刺激活化T细胞体外抗膀胱癌作用的影响目的：探讨B7-H1阻断对CD3AK细胞及CD3／CD28共刺激活化T细胞体外抗膀胱癌作用的影响。方法：分别利用CD3 mAb和CD3联合CD28 mAb刺激健康人外周血淋巴细胞诱导产生CD3AK细胞及CD3／CD28共刺激活化T细胞。然后于培养体系中加入B7-H1阻断型抗体阻断B7-H1通路，3H-TdR渗入法检测两种免疫效应细胞的体外增殖能力，ELISA法检测其分泌IFN-γ、TNF-α和IL-10的水平。最后，将两种免疫效应细胞分别作用于膀胱癌BIU-87细胞，MTT法检测其对BIU-87细胞的体外杀伤活性。结果：B7-H1被阻断后，CD3AK细胞及CD3／CD28共刺激活化T细胞的体外增殖能力明显增强，存活时间明显延长；并且其分泌IFN-γ、TNF-α的水平明显提高，而分泌IL-10的水平明显下降；同时B7-H1被阻断后，CD3AK细胞及CD3／CD28共刺激活化T细胞对BIU-87细胞的体外杀伤活性亦明显升高。结论：阻断B7-H1通路可以促进和维持CD3AK细胞及CD3／CD28共刺激活化T细胞的体外增殖和活化，并增强其杀伤膀胱癌细胞的免疫效应。B7-H1阻断有可能成为辅助增强膀胱癌过继细胞免疫治疗疗效的新策略。

论文目录

• 英文缩略词中英文对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 膀胱癌组织中B7-H1的表达及其临床意义
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 膀胱癌细胞系BIU-87中B7-H1的表达及LPS对其表达的诱导作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 B7-H1参与膀胱癌细胞免疫逃逸的体外实验研究及其干预性治疗
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第四部分 B7-H1阻断对CD3AK细胞及CD3/CD28共刺激活化T细胞体外抗膀胱癌作用的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述一 B7-H1在肿瘤免疫逃逸及免疫治疗中的研究进展
• 参考文献
• 综述二 缺氧诱导因子-1在泌尿系统肿瘤方面的研究进展
• 参考文献
• 附录 博士在读期间发表的论文及参与的课题项目
• 致谢