用于细胞内自由基区域定位识别的新型荧光探针的设计、合成及应用

论文摘要

细胞是生物形态结构和生命活动的基本单位。大量微量或痕量活性物种（小分子和离子）,如各种活性氧（主要包括超氧阴离子自由基O2-·、过氧化氢H2O2、羟基自由基?OH、脂质氢过氧化物ROOH、脂自由基ROO·、过氧化亚硝酰ONOO-、一氧化氮NO等）,各种金属离子(如铁离子Fe2+或Fe3+、锌离子Zn2+、铜离子Cu2+等),这些细胞内的活性物种通过各种生化反应参与调控细胞的凋亡、变异与分化、信号转导等生理功能与现象。适量的这些活性物种是生物体所必须的物质,但在某些环境（如氧化胁迫）下他们过量又会给生物体带来损伤。由于细胞内不同细胞器的形态结构与功能不同,在同一细胞内不同的细胞器中生物活性物种存在的种类与浓度也不尽相同。比如线粒体是O2-·等活性氧（ROS）产生的主要部位,细胞质和质膜是Fe2+或Fe3+的高发性部位,而酸性细胞器如溶酶体的H+浓度较高,神经细胞突出的囊泡中存在较高浓度的Zn2+。如果对不同细胞器内所存在的功能性活性物种能够及时准确地进行区域定位检测,那么既可以更加详尽地了解活性物种的产生和作用机制等生物学功能,又可以进一步在亚细胞水平探讨不同细胞器的功能,从而能够对这些活性物种的产生、存在、作用机制的研究更加精细和深刻。目前常用的分析检测细胞内活性物种的方法有电子自旋共振法（ESR）、化学发光法、荧光法、色谱法等,其中荧光法由于灵敏度高,选择性好,而且操作简便,常用于活性物种的测定。而荧光法结合激光扫描共聚焦显微技术,能够有效地实现活细胞和组织内ROS等功能性活性物种“实时、可视、定量”的高灵敏度检测,不仅可作原位实时动态监测,具有实验过程快速,样品处理简便,数据全面等优点,还能显示单个细胞以及细胞器内的荧光强度变化,将检测提高到单细胞水平和亚细胞水平。由此可见,发展选择性好、灵敏度高的分子荧光探针,对动植物活体细胞某一区域内的活性物种动态、原位可视化成像分析是当前生命科学研究的重要热点和难点领域之一。本论文基于荧光探针与活性氧自由基或其它生物活性分子特异性作用后荧光光谱性质的改变从而实现对特定物质的检测,并将所设计探针通过用于生物活体细胞的共聚焦显微成像显示其对某一细胞区域的定位。主要开展了以下两方面研究工作:（一）设计合成了一种用于检测超氧阴离子的新型近红外定位荧光探针。该探针的结构由两部分组成:一部分是以带羧基的Cy7作为荧光团;另一部分是对超氧阴离子有特异性反应的苯并噻唑啉作为响应基团。探针的合成路线简单、快捷,并且通过1HNMR和13CNMR对探针的结构进行了表征,研究了其相关光谱性质。实验表明,该探针能够在短时间内实现对超氧阴离子高灵敏度、高选择性的检测。此外,激光共聚焦荧光成像的实验结果表明该探针能够成功的定位到线粒体,并对超氧阴离子自由基的浓度变化专一性的响应。（二）设计合成了两种定位到细胞内线粒体的近红外荧光分子探针,用于检测超氧阴离子自由基。实验结果表明,该探针能够在近红外区域选择性地检测超氧阴离子自由基,通过分别引入的三苯基膦和赖氨酸基团,成功地实现了探针在线粒体中荧光共聚焦成像分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 第一节 引言
• 第二节 超氧阴离子荧光探针的主要设计原理
• 第三节 超氧阴离子的重要生理意义及其研究进展
• 第四节 探针在细胞内区域定位的重要意义及其研究进展
• 第五节 论文选题的目的与意义
• 参考文献
• 第二章 一种用于检测超氧阴离子的近红外定位荧光探针的合成及生物应用
• 1. 引言
• 2. 实验部分
• 3. 结果与讨论
• 4. 结论
• 参考文献
• 第三章 两种新型的定位到线粒体的近红外荧光探针的合成及细胞成像分析
• 1. 引言
• 2. 实验部分
• 3. 结果与讨论
• 4. 阶段性结论
• 5. 下一步实验计划
• 参考文献
• 附录一 化合物的核磁共振、质谱图
• 附录二 硕士期间发表的学术论文及参加的课题
• 致谢