百草枯对人胚胎神经干细胞损伤的机制研究

论文摘要

百草枯（Paraquat, PQ）是一种广泛使用的除草剂。流行病学研究表明长期暴露于PQ可以导致神经系统病变,尤其是帕金森病（Parkinson’s Disease, PD）。PQ进入中枢神经系统后,会对黑质多巴胺递质系统（DA）造成特异性的损伤。PQ低剂量腹腔注射可致成年C57BL小鼠黑质部多巴胺能神经元减少,并导致神经功能和行为障碍。因此现有研究多侧重于PQ对大脑多巴胺能神经元的影响,关于神经发育期暴露于PQ,进而对神经系统产生影响的研究报道较少。神经干细胞（Neural stem cells, NSCs）的发现以及离体培养为研究PQ的神经毒性提供了新的工具。NSCs可以在体外进行自我更新,完成多向分化。化学物可以通过干扰NSCs的正常增殖以及分化过程影响神经系统的正常发育和功能。本研究对永生化的NSCs （ReNcell CX细胞）进行了离体培养和诱导分化,并以此为模型,研究PQ对NSCs体外增殖和分化的影响,探讨可能的损伤机制和信号通路,以期为进一步探讨PQ的神经发育毒性提供科学依据。1人胚胎神经干细胞（ReNcell CX细胞）的体外培养与诱导分化ReNcell CX细胞为取自人胚胎大脑皮层的NSCs,并经c-myc基因转染使之永生化。本研究以添加EGF和bFGF的无血清培养基对ReNcell CX细胞进行了成功培养,获得大量nestin蛋白表达强阳性的细胞。经诱导分化后,可获得表达相应特异性标志蛋白的神经元（β-tublinⅢ）、星形胶质细胞（GFAP）及极少量少突胶质细胞（因一次分化中少于1%,故未得到免疫荧光染色阳性图片）。ReNcell CX细胞的成功培养和诱导分化,为后续研究PQ的神经发育毒性提供了良好的细胞模型。2百草枯对ReNcell CX细胞增殖及分化的影响2.1百草枯对ReNcell CX细胞增殖的影响利用Alamar Blue法检测ReNcell CX细胞的增殖活力。结果表明,随PQ浓度的增加,细胞增殖活力下降,浓度大于100μM的PQ可以显著抑制细胞增殖。利用活性氧检测试剂盒、caspase3活性检测试剂盒、细胞内钙离子浓度测定试剂盒对染毒后细胞内ROS水平、caspase3活性、钙离子浓度进行检测,发现PQ可以显著提高细胞内ROS水平（PQ≥10μM）、caspase3活性（PQ≥10μM）、钙离子浓度（PQ≥10μM）, caspase3活性、钙离子浓度随PQ浓度的升高而升高,呈明显剂量效应关系。该结果表明PQ可以抑制ReNcell CX细胞的增殖,引起细胞内氧化还原系统失衡,诱导细胞凋亡的发生2.2百草枯对ReNcell CX细胞金属硫蛋白Ⅲ表达的影响利用荧光定量PCR技术检测PQ染毒24h后细胞MT-ⅢmRNA的表达情况。不同浓度的PQ可以先上调而后下调MT-ⅢmRNA的表达情况。MT-ⅢmRNA表达的上调可以缓解一定浓度内PQQ氧化应激产生的活性氧对细胞产生的影响,从而保护细胞。2.3百草枯对ReNcell CX细胞分化的影响利用荧光定量PCR技术检测NSCs标志物nestin、Sox10,神经元标志物NF-68、NF-200,功能学受体NMDA-R和GABAA-R,星形胶质细胞标志物GFAP,凋亡相关基因bcl2 mRNA的表达情况。PQ可以上调ReNcell CX细胞nestin、bcl2 mRNA的表达,抑制Sox10、NF-68、NF-200、NMDA-R2A mRNA的表达,对GFAP、GABAA-R mRNA的表达无影响。该结果表明PQ可以在分化早期提前启动分化进程,并抑制ReNcell CX细胞向神经元方向的分化,影响其功能成熟。PQ对分化产生影响的浓度低于其抑制细胞增殖的浓度。3百草枯对ReNcell CX细胞分化信号通路的影响3.1百草枯对ReNcell CX细胞分化过程中Wnt信号分子表达的影响利用荧光定量PCR技术检测Wnt信号通路关键分子β-catenin和DVL2 mRNA的表达情况。PQ可显著下调β-catenin和DVL2 mRNA的表达,其中DVL2 mRNA下调的程度与PQ浓度之问存在明显的剂量反应关系。3.2百草枯对ReNcell CX细胞分化过程中Notch信号分子表达的影响利用荧光定量PCR技术检测Notch信号通路关键受体Notch1、配体Jagged1和下游分子DTX1 mRNA的表达情况。PQ在分化初期可以下调Notch1、Jagged1和DTX1的表达,分化中期会上调Notch1的表达,但在分化晚期至结束阶段,PQ对Notch1、Jagged1和DTX1的表达呈抑制状态。3.3百草枯对ReNcell CX细胞分化过程中Hedgehog信号分子表达的影响利用荧光定量PCR技术检测Hedgehog信号通路关键分子Shh和Gli1 mRNA的表达情况。PQ可以显著抑制Hedgehog信号通路中Shh及Gli1 mRNA的表达,但一定剂量的PQ（1.00μmol/L）可以在分化初期上调Gli1 mRNA的表达。PQ可以通过影响信号通路中关键分子mRNA的表达情况,调控NSCs的增殖和分化时点和方向,进而影响NSCs的分化结局。信号通路对PQ毒性较分化过程更为敏感。结论：PQ可以抑制ReNcell CX细胞的增殖,减少干细胞数量；在抑制细胞增殖的浓度以下已经能够影响ReNcell CX细胞的分化结局和分化后细胞的功能成熟,在更低浓度时已经影响了ReNcell CX细胞分化过程中,尤其是分化早期信号通路关键分子的表达。PQ对ReNcell CX细胞增殖、分化及信号通路产生影响的PQQ浓度高低依次为：信号通路≤分化≤增殖。来自胚胎时期的NSCs可以在一定程度上减缓或修复PQ的损伤作用。

论文目录

• 主要缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 人胚胎神经干细胞（ReNcell CX细胞）的体外培养与诱导分化
• 1 材料与方法
• 2 研究结果
• 3 讨论
• 第二章 百草枯对ReNcell CX细胞增殖及分化的影响
• 第一节 百草枯对ReNcell CX细胞增殖的影响
• 1 材料与方法
• 2 研究结果
• 3 讨论
• 第二节 百草枯对ReNcell CX细胞金属硫蛋白Ⅲ表达的影响
• 1 材料与方法
• 2 研究结果
• 3 讨论
• 第三节 百草枯对ReNcell CX细胞分化的影响
• 1 材料与方法
• 2 研究结果
• 3 讨论
• 第三章 百草枯对ReNcell CX细胞分化信号通路的影响
• 第一节 百草枯对ReNcell CX细胞分化过程中Wnt信号分子表达的影响
• 第二节 百草枯对ReNcell CX细胞分化过程中Notch信号分子表达的影响
• 第三节 百草枯对ReNcell CX细胞分化过程中Hedgehog信号分子表达的影响
• 主要结论
• 主要结果示意图
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 硕士研究生期间已（待）发表论文
• 致谢