猪内源性反转录病毒的检测、启动子活性分析及载体构建

论文摘要

临床上，供体器官的严重短缺，使人们将目光转向了异种移植。到目前为止，猪被认为是最适合的异种移植供体。但研究发现，以前病毒DNA形式整合进猪体细胞基因组中的猪内源性反转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）在体外能够感染多种人源细胞，这引起了人们对异种移植安全性的广泛关注。我国有着丰富的小型猪种资源，目前已经开展猪-人异种器官／组织移植的相关研究，但有关小型猪中PERV的携带、表达情况以及内源性释放毒株的生物学特性方面报道甚少，因此有必要开展这方面的研究工作，了解我国小型猪中PERV存在的本底，为异种器官受体提供安全可靠的器官，同时通过分析PERV5′非编码区的启动子活性，为进一步研究PERV的生物学特性搭建技术平台。另外，由于传统的逆转录病毒载体在介导基因转移的过程中存在着包装病毒的滴度较低以及某些病原的安全问题，而基于PERV的长末端重复序列构建的逆转录病毒载体则有可能解决这些问题，因为PERV是猪在进化过程中获得的反转录病毒序列，每个细胞中PERV的拷贝数约为8-15个，尚未发现其致病性，并且由于在猪源细胞中有同源序列的存在，转染载体至猪源细胞有可能获得较高的包装病毒滴度。目前国际上对PERV的研究均着眼于异种移植中其病原安全性的评价等方面，至今尚未见有利用其作为逆转录病毒载体的报道，因而，本研究也构建了以PERV长末端重复序列为调控序列的逆转录病毒载体。本研究主要进行以下三个方面的工作： 1．中国五指山猪中PERV存在与表达情况的调查 检测分析猪内源性反转录病毒（porcine endogenous retrovirus；PERV）在中国五指山猪中的携带、表达情况。首先根据军事医学科学院野战输血研究所已建立的PCR、RT-PCR方法，应用通用的env基因分型方法检测PERV env-A、env-B、env-C在我国主要小型猪种之一的五指山猪基因组中的存在与表达情况。随后又对五指山猪中PERV核心蛋白基因（gag）、多聚酶基因（pol）及囊膜基因（env）的存在与表达进行检测。结果发现：从病毒存在的情况看，我国五指山猪基因组中普遍存在PERV，其阳性率达100％。PERV的存在以A亚型最高（97.01％），其次为B亚型（94.03％），此次未检测到C亚型的存在；从病毒的表达情况看，PERV-B亚型的表达率高于A亚型，但所有的样品均未检测到PERV-C型的表达。从病毒主要结构蛋白的存在与表达情况看，五指山猪基因组中不仅存在PERV

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• 1.中国五指山猪中PERV存在与表达情况的调查
• 2.对PERV 5’非编码区启动子活性的分析
• 3.基于PERV长末端重复序列的逆转录病毒载体的构建
• Abstract
• 缩略词（Abbreviation）
• 第一部分 猪内源性反转录病毒的研究进展（综述）
• 1 PERV分子生物学特性的研究
• 1.1 PERV的生活周期
• 1.2 PERV的形态学特征
• 1.3 PERV的基因组结构及功能
• 1.4 PERV基因组编码的蛋白质及功能
• 1.4.1 核心蛋白（gag）
• 1.4.2 酶蛋白（pol）
• 1.4.3 囊膜蛋白（env）
• 2 PERV的感染性与异种移植的安全性
• 3 PERV检测技术的研究进展
• 3.1 病毒的分离与鉴定
• 3.2 血清学诊断试验
• 3.3 单克隆抗体技术
• 3.4 分子生物学诊断技术
• 4 展望
• 第二部分 中国五指山猪中PERV存在与表达情况的调查
• 1 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 检测样品
• 2.1.2 工具酶和试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要溶液配制
• 2.2 外周血淋巴细胞的分离
• 2.3 PBL DNA的制备
• 2.3.1 细胞的消化
• 2.3.2 核酸抽提与纯化
• 2.4 PBL RNA的制备
• 2.5 引物的设计与合成
• 2.6 PCR扩增与分析
• 2.7 RT-PCR反应与分析
• 3 结果
• 3.1 中国五指山猪基因组中PERV亚型存在的检测
• 3.2 PERV编码基因存在的检测
• 3.3 PERV亚型表达的检测
• 3.4 PERV编码基因表达的检测
• 4 讨论
• 4.1 PERV的存在
• 4.2 PERV的表达
• 5 结论
• 第三部分 猪内源性反转录病毒5’非编码区启动子活性的分析
• 1 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 细胞
• 2.1.3 工具酶及主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 主要溶液配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物的设计与合成
• 2.2.2 PCR扩增
• 2.2.3 重组PCR
• 2.2.4 PCR产物的回收与纯化
• 2.2.5 PCR产物的克隆
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.7 连接产物及质粒的转化
• 2.2.8 重组质粒的快速鉴定
• 2.2.9 质粒的制备
• 2.2.10 重组质粒外源片段插入方向的鉴定
• 2.2.11 萤光素酶表达载体的构建
• 2.2.12 纯化质粒及检测
• 2.2.13 转染COS-7细胞
• 2.2.14 萤光素酶报告基因检测
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增
• 3.2 重组质粒的筛选和插入子方向的鉴定
• 3.3 测序结果
• 3.4 转录因子结合位点预测
• 3.5 PGL3系列重组质粒的筛选
• 3.6 各转染质粒浓度及纯度检测结果
• 3.7 含有不同功能区的UTR的启动子活性
• 4 讨论
• 4.1 PERV UTRs的结构
• 4.2 WZSP-PERV的进化年龄
• 4.3 R区
• 4.4 U3重复区
• 4.5 U3上游序列
• 4.6 UTR的下游序列（PBS和前导序列）
• 5 结论
• 第四部分 逆转录病毒载体研究进展（综述）
• 1 逆转录病毒的生物学特性
• 2 逆转录病毒载体
• 2.1 逆转录病毒载体的优点
• 2.2 逆转录病毒载体的缺点
• 2.3 逆转录病毒载体系统的构建
• 3 逆转录病毒载体的类型
• 3.1 双表达载体
• 3.2 VIP载体
• 3.3 自我失活型载体
• 3.4 非自动失活的定位表达载体
• 4 逆转录病毒载体的安全性
• 5 逆转录病毒载体的应用及前景
• 第五部分 基于猪内源性反转录病毒长末端重复序列的逆转录病毒载体的构建
• 1 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 工具酶及主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 常用溶液配制
• 2.1.5 Southern blotting试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物的设计与合成
• 2.2.2 PCR扩增
• 2.3 重组质粒MIGR1-5’UTR的构建
• 2.4 载体MIGR1-PERV（pMP）的构建
• 2.5 含neo基因的MIGR1-PERV-neo及MIGR1-neo载体（pMPN,pMN）的构建
• 2.6 纯化质粒及检测
• 2.7 转染PK-15细胞
• 2.8 G418抗性筛选
• 2.9 基因组DNA的提取
• 2.10 基因组DNA的PCR检测
• 2.11 Southern blotting检测
• 2.11.1 酶切与电泳
• 2.11.2 探针制备
• 2.11.3 标记探针
• 2.11.4 Southern印迹转移
• 2.11.5 杂交
• 2.11.6 洗膜
• 2.11.7 显色反应
• 2.12 pMPN和pMIGR1-5,UTR分别与包装质粒共转染HEK293-T细胞
• 2.13 pMPN载体与包装质粒共转染PK-15细胞
• 3 结果
• 3.1 扩增PERV 5’UTR,3’LTR,neo基因结果
• 3.2 重组质粒MIGR1-5’UTR酶切鉴定结果
• 3.3 pMP酶切鉴定结果
• 3.4 pMPN及pMN酶切鉴定结果
• 3.5 纯化质粒检测结果
• 3.6 pMPN、pMN转染PK-15结果
• 3.7 流式细胞分析转染效果
• 3.8 G418压力筛选阳性细胞
• 3.9 基因组DNA PCR检测neo基因
• 3.10 基因组DNA酶切及相应质粒酶切
• 3.11 Southern blotting
• 3.12 pMPN和pMIGR1-5’UTR分别与包装质粒共转染HEK293-T细胞结果
• 3.13 pMPN转染PK-15细胞包装结果
• 4 讨论
• 4.1 pMP载体的结构
• 4.2 pMPN的构建元件IRES
• 4.3 pMPN的表达及整合能力
• 4.4 pMPN的转染效率
• 4.5 pMP与异源结构蛋白的结合能力
• 4.6 pMP与不同类型PERV结构蛋白的结合能力
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简历