实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA体系建立及临床应用初步研究

论文摘要

目的:建立实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA方法,测定重型乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA含量,并进一步探索人工肝支持系统对重型乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA的影响。方法:用不同浓度质粒标准品建立实时荧光定量PCR标准曲线,并检测该方法的灵敏性及重复性;HBV DNA阳性的慢性乙型肝炎（轻度）患者血清标本提取物经PlasmidSafeTMATPdependent DNase酶切纯化后进行实时荧光定量PCR反应,验证该方法的特异性。以50例重型乙型肝炎患者人工肝血浆置换治疗前后PBMC作为检测标本,用已建立的实时荧光定量PCR方法对HBV cccDNA含量进行定量检测。用SAS8.1统计软件对结果进行统计学分析。结果:成功建立了HBV cccDNA实时荧光定量PCR检测方法,线性范围为1×102～2.77×109拷贝/ml。经特异性酶切消化后慢性乙型肝炎（轻度）患者血清中未检测到HBV cccDNA,重型乙型肝炎患者PBMC中存在HBV cccDNA。在人工肝血浆置换前后PBMC中HBV cccDNA含量（中位数log10值）分别为3.73,3.54（n=50,P>0.05）。血清总HBV DNA与PBMC中HBV cccDNA之间有较好的相关性（r=0.39,P<0.01）。总HBV DNA水平与PT（r=0.37,P<0.01）、ALT（r=0.29,P<0.05）、AST（r=0.39,P<0.01）水平呈正相关;HBV cccDNA水平与PT（r=0.34,P<0.05）、ALT（r=0.34,P<0.05）、AST（r=0.40,P<0.01）水平呈正相关。结论:本研究结果显示,所建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的线性范围、灵敏度、特异性及重复性。重型乙型肝炎患者PBMC中存在HBV cccDNA。血清总HBV DNA与PBMC中HBV cccDNA呈正相关;总HBV DNA、HBV cccDNA与PT、ALT、AST呈正相关,说明总HBV DNA、HBV cccDNA均能在一定程度上反映肝脏损伤程度且有较好的一致性。在人工肝血浆置换后重型乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA含量无明显降低。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 实时荧光定量 PCR 检测 HBV CCCDNA 体系的建立
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二部分 人工肝支持系统对重型乙型肝炎患者PBMC 中HBV CCCDNA 影响的初步研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文