雌二醇对巨噬细胞吞噬功能的影响及其机制的研究

论文摘要

研究背景和目的动脉粥样硬化是一种与血脂异常及血管壁成分改变有关的动脉疾病。脂质在动脉血管内膜的沉积[1],引起内膜纤维增厚及其深部成分的坏死,崩解,形成粥样物。由于成年女性随着年龄的增加,雌激素的水平逐渐降低[2],而绝经前女性动脉粥样硬化性心脏病总体发病率较绝经后妇女低[3]。因此长期以来传统观点认为:雌激素起动脉粥样硬化保护作用,这一点也得到许多整体动物实验的支持[4],并且认为其保护作用机制包括脂代谢途径（如降低LDL,升高HDL）和非脂代谢途径（如稳定粥样斑块）[4-5]。然而临床研究发现绝经后妇女雌激素替代疗法却能够增加心肌梗死,卒中,静脉血栓,乳腺癌、子宫内膜癌的风险[6]。进一步研究表明:虽然绝经前期、绝经期、或绝经后早期补充雌激素有利于降低动脉粥样硬化性疾病的发病风险,但是绝经后晚期补充雌激素却使得动脉粥样硬化性疾病的发病风险增加[7],目前对雌激素在不同年龄阶段显示出的双向性作用还没有很好的解释。动脉粥样硬化始动因素是由于巨噬细胞吞入修饰的低密度脂蛋白,脂质斑块在大动脉壁聚积。各种危险因素可以损伤内皮细胞,单核细胞通过细胞黏附因子（VCAM, ICAM,selectins等）与内皮细胞黏附并向内皮下迁移。在内皮下,单核细胞在巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）的作用下分化成巨噬细胞,通过清道夫受体（SR-A和CD36等）吞噬氧化性低密度脂蛋白（Ox-LDL）逐渐形成泡沫细胞,巨噬细胞在动脉粥样硬化的起始和发展中起关键性的作用[1]。动脉粥样硬化的发生发展过程实际上可以看作是巨噬细胞对“内源性异物（Ox-LDL）”的清除反应,单核细胞的黏附、迁移、分化、吞噬及泡沫细胞的形成则是该过程的关键[1]:由单核/巨噬细胞iNOS所产生的大量NO,可以引发氧化应激反应,氧化LDL为Ox-LDL或硝基LDL（NO2-LDL）,Ox-LDL通过MAPK的磷酸化作用调节PPARγ的活性,上调清道夫受体CD36表达,从而促进巨噬细胞吞噬Ox-LDL,促进泡沫细胞形成[1];同时,Ox-LDL也可直接引起JNK磷酸化,从而促进另一个清道夫受体SR-A磷酸化[1],并使之表达增加,从而促进巨噬细胞吞噬Ox-LDL,促进泡沫细胞形成;iNOS还可诱导巨噬细胞凋亡[1],另外,NO通过不同的机制调节IL-8和TNF-a的生成,巨噬细胞在TNF-α、IL-1的诱导下,巨噬细胞可释放金属蛋白酶（MMP）蛋白[8],金属蛋白酶能特异性地与细胞外基质（ECM）成分相结合并降解,减弱新生血管形成增加了斑块的不稳定性,促进斑块破裂和血栓形成[1]。可见,单核/巨噬细胞在动脉粥样硬化的发生发展的炎症反应过程中起着非常重要的作用,其已经成为新的非常重要的治疗动脉粥样硬化的靶点.研究表明,在人和鼠iNOS基因存在雌激素受体反应元件（vitellogenin ERE,AGGTCAnnnTGACCT）[9],雌激素能促进巨噬细胞致炎因子iNOS表达[10],激活巨噬细胞,此外,雌激素还能促进TNF-α表达[11],促进NO的生成[12],故而雌激素其实是促进炎症反应发生的。因此,绝经后晚期妇女补充雌激素,由于雌激素的促炎效应,结果造成动脉粥样斑块不稳定,诱发血管急性事件,最终造成动脉粥样硬化性疾病的风险增加。然而单一的量效关系与“在绝经前、绝经期和绝经后早期,雌激素对动脉粥样硬化的保护作用”的现象相矛盾;也会与临床现象“虽然随年龄的增加,女性患动脉粥样硬化的总患病率会增加,但是在绝经期患病风险大大增加[7],而在55-60岁左右心血管疾病事件的发生率呈指数增加[3]”相矛盾。为解释这矛盾现象,本研究拟以诱导鼠源单核细胞源性巨噬细胞RAW264. 7为靶细胞,通过建立Ox-LDL诱导的巨噬细胞源泡沫细胞模型,给予不同剂量的雌二醇干预,观察雌二醇（E2）对Ox-LDL诱导的巨噬细胞吞噬功能的影响,并研究其可能的作用机制。方法鼠源单核细胞源性巨噬细胞RAW264. 7细胞培养,分为未经Ox-LDL诱导组和经75 mg·L-1 ox-LDL诱导12小时的诱导组。其中Ox-LDL诱导组又分为空白对照组,DMSO组（溶剂对照）,l pmol·L-1E2组,25 pmol·L-1E2组,50 pmol·L-1E2组,100 pmol·L-1E2组,油红染色观察巨噬细胞对Ox-LDL的吞噬情况,半定量逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）测定巨噬细胞清道夫受体CD36,SR-BI精氨酸酶Ⅰ（ARG1）,诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表达,硝基还原酶法测定NO的含量结果与未经Ox-LDL诱导组相比较,经Ox-LDL诱导的空白对照组的巨噬细胞对脂滴的吞噬明显增加,CD36、SR-BI、iNOS、ARG1 mRNA的表达明显增加,细胞培养液中NO的含量明显增加（P <0.05）;经ox-LDL诱导DMSO组,l pmol·L-1E2组与空白对照组比较,巨噬细胞对脂滴的吞噬、CD36、SR-BI、iNOS、ARG1 mRNA的表达、细胞培养液中NO的含量的影响均无显著性差异,然而,经ox-LDL诱导组中的25 pmol·L-1 ,50 pmol·L-1 ,100 pmol·L-1E2组巨噬细胞对脂滴的吞噬较经ox-LDL诱导DMSO组均明显增加,CD36mRNA表达显著性增加,iNOS mRNA的表达显著性增加,ARG1 mRNA的表达显著性减少,细胞培养液NO的含量显著性增加（P <0.05）,且呈逆浓度变化趋势。而SR-BI mRNA的表达无显著性差异。E2（1～100 pmol/L）能促进小鼠源单核巨噬细胞RAW264. 7对Ox-LDL的吞噬,促进CD36 mRNA的表达,并促进iNOS mRNA表达和NO的生成,作用呈现“抛物线”变化趋势,最大效应在25 pmol·L-1附近。结论E2(1～100 pmol·L-1 )能促进小鼠源单核巨噬细胞RAW264. 7对Ox-LDL的吞噬,促进CD36的mRNA表达,可能由于E2促炎效应。E2有促进动脉粥样硬化性疾病发生风险增高的倾向,作用呈现“抛物线”变化趋势,其作用机制促进巨噬细胞致炎因子iNOS表达,促进NO的生成,大量NO引发氧化应激反应,氧化LDL并促进CD36 mRNA的表达,巨噬细胞吞噬Ox-LDL逐渐形成泡沫细胞,导致动脉粥样硬化的发生。

论文目录

• 缩写词（Abbreviation）
• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 雌二醇对巨噬细胞吞噬功能的影响
• 一前言
• 二材料和方法
• 三结果
• 四讨论
• 第二部分 雌二醇对巨噬细胞iNOS、ARG1、NO 的影响
• 一前言
• 二材料和方法
• 三结果
• 四讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢