柔嫩艾美耳球虫cDNA文库的构建及其主要抗原基因的克隆与表达

论文摘要

顶复门都是由原生动物组成的寄生虫,它包含了一些重要的兽医寄生虫和医学寄生虫（如艾美耳球虫、疟原虫、巴贝斯虫、弓形虫、隐孢子虫、住肉孢子虫）。在各种寄生虫感染中,寄生在细胞内的艾美耳属球虫是主要制约现代家禽生产的一种原虫病。艾美耳球虫病不仅威胁家禽的健康和生命安全,而且在全球范围内可导致严重的经济损失。在各种艾美耳球虫中,寄生在盲肠中的柔嫩艾美耳球虫致病性最强。尽管采用了一些免疫学、生物技术学和遗传学的方法,但目前控制球虫病仍然主要依靠抗球虫的化学药物来预防。然而,由于许多抗球虫药出现了严重的抗药性而使用受限。加之药物或抗生素在家禽产品中的残留问题越来越受到消费者的关注,迫使人们寻求防治的新途径。在众多控制球虫的方法中,免疫学防治前景诱人。本研究选取柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）子孢子构建其cDNA表达文库,从中筛选、克隆免疫原基因,并进行表达、功能分析和动物免疫保护试验,获得了以下结果。1.用纯化的E. tenella杨凌株（YL）孢子化卵囊口服接种感染雏鸡,制备鸡抗E. tenella YL株阳性血清;用纯化的E. tenella YL株孢子化卵囊作为抗原,裂解后加佐剂乳化后免疫家兔,制备兔抗鸡E. tenella YL株阳性血清。结果表明,二者均可用于E. tenella cDNA表达文库的免疫学筛选。2.以E. tenella YL株孢子化卵囊为材料,首次用λSCREEN载体成功构建了E. tenella子孢子cDNA表达文库。经测定,库容量约为4×106 pfu/mL。能用特异性引物扩增出E. tenella子孢子表面抗原3-1E基因,说明文库质量高、代表性强。3.从cDNA表达文库中扩增得到鸡E. tenella YL 3-1E基因。利用生物信息学和分子生物学软件对3-1E基因编码的蛋白进行结构预测,表明该蛋白为一结构松散的球状蛋白。将3-1E基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-3-1E重组质粒并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物经SDS-PAGE分析,表明成功的表达出了分子质量为44.7 ku的融合蛋白。该研究为球虫基因工程疫苗的研制奠定了基础,也表明了所构建的E. tenella YL子孢子cDNA表达文库质量较高。4.利用E. tenella YL株阳性血清和兔抗鸡E. tenella YL株阳性血清对E. tenella子孢子cDNA表达文库进行免疫学筛选,共获得3个阳性克隆,经鉴定,其中一个阳性克隆基因的阅读框（ORF）长为1 029 bp,共编码342个氨基酸。登陆GenBank比较,和已发表的MIC-2基因有很高的同源性,与已报道的E. tenella豪顿株（HT）和E. tenella北京株（BJ）的MIC-2基因ORF序列同源性分别为99.7%和99.8%,与二者氨基酸的

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 球虫病研究概况
• 1.1 球虫病研究简史
• 1.2 球虫的分类学
• 1.3 球虫卵囊形态特征
• 1.3.1 卵囊外形
• 1.3.2 卵囊大小
• 1.3.3 卵囊色泽
• 1.3.4 卵囊外膜
• 1.3.5 卵膜孔（微孔）
• 1.3.6 卵囊残体
• 1.3.7 孢子囊
• 1.3.8 极粒
• 1.3.9 孢子囊残体
• 1.3.10 子孢子
• 1.4 球虫生活史
• 1.4.1 孢子生殖（Sporogony）
• 1.4.2 裂殖生殖（shizogony）
• 1.4.3 配子生殖（gametogony）
• 第二章 球虫体外培养的研究进展
• 2.1 球虫的细胞培养
• 2.1.1 培养基
• 2.1.2 卵囊的制备
• 2.1.3 鸡肾细胞的制备
• 2.1.4 子孢子的制备、纯化及接种
• 2.1.5 各种艾美耳球虫在细胞培养基上的发育
• 2.1.6 细胞培养基上艾美耳球虫的发育过程
• 2.2 球虫在鸡胚中的培养
• 2.2.1 球虫在鸡胚中的发育及病理反应
• 2.2.2 影响球虫在鸡胚中发育的因素
• 2.3 结语
• 第三章 艾美耳球虫功能基因组的研究进展
• 3.1 功能基因组学的概念
• 3.2 功能基因组学研究的主要内容、意义及其方法
• 3.2.1 功能基因组学研究的主要内容
• 3.2.2 功能基因组学研究的意义
• 3.2.3 功能基因组学的研究方法
• 3.3 艾美耳球虫基因组
• 3.3.1 分子核型
• 3.3.2 基因组研究
• 3.3.3 鸡球虫基因的研究进展
• 第四章 鸡球虫免疫及疫苗的研究进展
• 4.1 鸡球虫的免疫原性
• 4.1.1 免疫原性
• 4.1.2 抗原分子及抗原基因的分析与鉴定
• 4.2 宿主的免疫应答作用与保护性免疫作用机制
• 4.2.1 免疫应答作用
• 4.2.2 宿主保护性免疫作用机制
• 4.3 交叉免疫问题
• 4.4 球虫疫苗的研究概况
• 4.4.1 强毒苗
• 4.4.2 弱毒苗
• 4.4.3 亚单位疫苗
• 4.4.4 重组疫苗
• 4.4.5 核酸疫苗
• 4.4.6 展望
• 第五章 柔嫩艾美耳球虫卵囊的收集及阳性血清的制备
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.1.3 免疫血清的检测
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 单一种E.tenella YL 株卵囊收集的结果
• 5.2.2 鸡抗E.tenella YL 株阳性血清ELISA 检测结果
• 5.2.3 兔抗鸡E.tenella YL 株阳性血清ELISA 检测结果
• 5.3 讨论
• 第六章 柔嫩艾美耳球虫CDNA 表达文库的构建
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 总RNA 提取和mRNA 分离
• 6.2.2 双链cDNA 检测结果
• 6.2.3 大片段cDNA 的选择
• 6.2.4 cDNA 文库基础库容量
• 6.2.5 扩增文库库容量
• 6.2.6 cDNA 表达文库插入片段长度分析
• 6.3 讨论
• 6.3.1 孢子化卵囊和子孢子的质量问题
• 6.3.2 总RNA 和mRNA 的质量问题
• 6.3.3 m RNA 分离及引物的选择
• 6.3.4 cDNA 表达文库的质量问题
• 第七章 柔嫩艾美耳球虫YL 株3-1E 基因的克隆、表达与蛋白结构预测
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 E. tenella YL 3-1E 基因的克隆
• 7.2.2 E. tenella YL 3-1E 基因序列测定及序列分析
• 7.2.3 3-1E 蛋白结构预测
• 7.2.4 重组表达质粒pGEX-3-1E 的构建及鉴定
• 7.2.4 重组表达质粒pGEX-3-1E 的构建及鉴定
• 7.2.5 3-1E 基因表达产物SDS-PAGE 分析
• 7.3 讨论
• 第八章 柔嫩艾美耳球虫CDNA 表达文库的免疫学筛选与克隆
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 材料
• 8.1.2 方法
• 8.2 结果
• 8.2.1 阳性克隆的筛选结果
• 8.2.2 阳性噬斑PCR 扩增结果
• 8.2.3 阳性克隆的重组质粒鉴定结果
• 8.2.4 目的片段的序列测定及分析结果
• 8.3 讨论
• 第九章 MIC-2 基因的表达与功能分析
• 9.1 材料与方法
• 9.1.1 材料
• 9.1.2 方法
• 9.2 结果与分析
• 9.2.1 重组表达质粒pGEX-MIC-2 的构建及鉴定
• 9.2.2 MIC-2 基因表达产物SDS-PAGE 分析
• 9.2.3 MIC-2 基因及其编码蛋白的结构预测
• 9.3 讨论
• 9.3.1 外源蛋白质融合表达策略
• 9.3.2 外源蛋白质表达部位选择策略
• 9.3.3 生物信息学技术分析预测编码蛋白的结构与功能策略
• 9.3.4 MIC-2 外源蛋白融合表达的特点
• 第十章 重组表达抗原对鸡球虫感染的免疫保护效果研究
• 10.1 材料与方法
• 10.1.1 材料
• 10.1.2 方法
• 10.2 结果与分析
• 10.2.1 可溶性蛋白的Western-blotting 分析结果
• 10.2.2 蛋白含量
• 10.2.3 增重变化
• 10.2.4 克盲肠内容物卵囊数
• 10.2.5 盲肠病变记分情况
• 10.2.6 抗球虫指数（ACI）
• 10.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略语英汉对照表
• 致谢
• 作者简介