高效聚磷菌的筛选、ppk基因的克隆及其应用研究

论文题目: 高效聚磷菌的筛选、ppk基因的克隆及其应用研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 蔡天明

导师: 李顺鹏

关键词: 高效聚磷菌的筛选,基因的克隆,废水,厌氧释磷,好氧吸磷,强化除磷

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 水体富营养化是全球十大环境问题之一。氮磷尤其是磷的输入是引起水体富营养化的关键因素。城镇生活污水的排放是水体磷污染的主要来源之一。为解决磷污染所带来的危害，在污水进入水体前进行有效处理，降低排放污水的磷浓度十分必要。目前世界各地大规模污水处理厂主要采用强化生物除磷工艺（EBPR），EBPR工艺具有污泥产生量少、不使用化学物质和运行经济等特征。在EBPR系统中聚磷菌在磷的去除中起着至关重要的作用。但迄今为止，人们仅分离到Acinetobacter species、Microlunatus phosphorus Lampropedia spp．、Pseudomonas spp．等属的为数不多的PABs，而且这些菌纯培养时很少能表现出EBPR系统典型聚磷菌的厌氧特征，有关聚磷菌的工程化应用尚无报道；同时，由于微生物学家和工程专家结合不紧密，加之EBPR系统本身的复杂性，对EBPR的微生物学机理和分子机理了解不多，导致EBPR的稳定运行难以控制和整个生物聚磷研究进展不快。为此，加大聚磷菌的筛选力度，对聚磷菌的聚磷特性和聚磷关键基因，对聚磷菌的工程化应用进行研究十分必重要。本文以高效聚磷菌聚磷机理研究为主线，从高效聚磷菌的筛选着手，系统研究了高效聚磷菌的生物学特性、聚磷特性、与聚磷相关的ppk基因、高效菌株GM6的定殖及其强化废水生物除磷能力探索了GM6的工程化应用前景，构建了国内生物除磷研究的技术平台，取得了目前国内污水强化生物除磷基础研究和应用领域较为丰富的研究成果。一．聚磷菌的筛选及生物学特性改进了高效聚磷菌的筛选方法，筛选出了四株聚磷能力远高于国外报道的野生菌株聚磷水平的高效聚磷株：采取大通量高流量的原则，采用平板梯度稀释涂布、poly-P和PHB染色和蓝白斑筛选获得初选聚磷菌25株；经好氧和厌氧培养确定了四株高效聚磷菌GM1、GM6、GM18和GM21，选择GM1和GM6作为研究材料。经生理生化鉴定和16S rDNA序列分析和同源性比较，GM1被初步鉴定为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）；GM6被初步鉴定为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。GM1在合成废水中生长时，最适初始pH为7.0，最适生长温度为30℃，当初始pH值大于8.5或小于5.5时或当温度小于5℃或大于33℃时生长较慢；GM6在合成废水中培养时，最适起始pH为6.5，最适生长温度为27℃，当初始pH值大于8.0或小于5.0时，或当温度小于5℃或大于37℃时生长较慢；装液量对GM1和GM6生长影响不大。二．GM1和GM6的聚磷特性GM1和GM6纯培养时表现出了典型PABs的特征，为生物除磷研究提供了宝贵的材料：GM1和GM6在合成废水中培养时，除磷最适初始pH值分别为6.5和7.0，当pH值小于5.5或大于7.5时，除磷能力均下降。GM1和GM6的最适除磷温度为20℃和27℃；当温度大于30℃或小于10℃时，GM1除磷效果明显变差；当温度大于33℃或小于5℃时，GM6的除磷效果明显变差。GM1和GM6对合成废水、MOPS培养基、LB培养基及YG培养基的好氧磷去除率分别在60％-89.6％和63％-96.6％之间（对照菌E．coli的去除率在13.6％-30.8％之间）。GM6的聚磷和放磷能力更强。当以乙酸为底物好氧培养时：GM1和GM6体内能聚集类脂粒PHB，菌体PHB浓度上升与乙酸的浓度下降呈负相关；GM1、GM6厌氧培养时，底物乙酸浓度下降与菌体PHB的上升和磷浓度的增加呈负相关；在起始1h内乙酸的吸收及磷的释放速度较快，随着乙酸的吸收和poly-P的分解，上清液中乙酸浓度下降，磷的浓度上升，两者呈负相关。三．GM6（Pseudomonas putida）多聚磷酸盐激酶基因ppk的克隆及表达国内首次克隆了聚磷菌的ppk基因，对ppk基因进行了表达，表达菌株的除磷效率较高。本研究根据ppk基因的保守区设计引物，从GM6的总DNA中扩增到ppk基因的528bp的片段，随后采用一种新型的扩增未知序列的PCR技术SEFA-PCR扩增片段的上下游基因序列，将扩增的片段和扩增的上下游序列进行拼接，用Omiga软件进行开放阅读框分析，预测ppk基因全长为2220bp。其上游为HemB基因，长度可能为1119bp。将GM6的ppk基因序列与其它已报道的ppk基因进行同源性比较，GM6与Pseudomonas putida KT2440、Pseudomonas aeruginosa PAO1、Pseudomonas syringae、Klebsiella aerogenes、Neisseria meningitidis、Acinetobacter sp.ADP1和Escherichia coli K12-MG1655在核对苷酸水平的同源性分别为82％、79％、84％、45％、63％、53％和22％；与Pseudomonas putida KT2440、Acinetobacter.sp.ADP1、Escherichia coli K12-MG1655、Neisseria meningitidis MC58和Pseudomonas aeruginosa PAO1在氨基酸水平的同源性分别为89％、58％、33％、50％和80％。构建的表达菌株E.coli BL21（DE3）／pET29a-ppk经IPTG诱导3h时，获得了ppk基因的表达产物，其分子量约81 kDa。表达菌株E.coli BL21（DE3）／pET29a-ppk 12h的磷去除率高达80％（而对照菌株磷去除率仅为18％），远高于国外报道的40％的磷去除率。表明ppk基因在E.coli中的过量表达，导致了E.coli菌体中poly-P的大量聚集，从而使得培养基中的磷酸盐大量的去除。四．高效聚磷菌GM6在活性污泥中的定殖及强化生物除磷应用研究首次将高效菌株进行了工程应用，获得了快速强化废水生物除磷的能力。利用三亲接合对高效聚磷菌GM6进行标记，获得gfp基因标记菌株GMTR。试验表明，应在厌氧起始时投加菌株，当接种量小于1％时，GMTR投菌后难以获得生长优势；接种量达到2％时，在装置运行12个循环后，按2％-7.5％四种不同的接种比例投菌时污泥中GMTR的比例相差不大。因此，实际投菌时，确定比例为2％。GMTR在R2中的定殖情况是：在R2的污泥中检出了GMTR，而对照R1污泥中在抗性平板上培养时末检出。投加GMTR至R2后，R2运行21d时，GMTR的比例升至9.2％，GMTR的菌数已占据优势。投加GMTR菌株后，磷的去除率逐渐提高，运行21d时磷的去除率升至96％，28d后出水浓度稳定在0.2 mg L-1左右。运行21d时，装置R2的厌氧和好氧污泥具备了EBPR的典型特征，厌氧1h，能快速放磷除有机物，好氧2h能有效除磷。因此，投加GM6能快速启动和恢复强化生物除磷能力。选择除磷能力较差的生活污水处理设施，利用GM6来强化其除磷能力，按2％比例投菌，投菌6d后，出水磷浓度逐渐下降，至25d时，出水磷浓度小于0.5 mg L-1，磷的去除率达96.8％。因此，GM6强化生物除磷效果显著。五．影响EBPR系统生物除磷的主要因素研究了进水乙酸浓度、厌氧生境、进水pH、好氧溶氧浓度及污泥泥龄对EBPR系统除磷效果的影响。厌氧45min时，释磷量随着进水中乙酸比例增加逐渐增大，仅以葡萄糖为碳源时释磷量仅为2.25 mg L-1，乙酸比例为15％时释磷量为16.69 mg L-1，乙酸比例大于30％时释磷量基本不变；厌氧120min时，进水乙酸比例对于磷释放量影响不大。过高的厌氧搅拌转速对厌氧释磷有影响，当转速过高时磷释放量下降。对系统释磷而言，最适pH6.5，当进水pH大于7.0或小于6.0时，磷释放量均下降，当pH大于7.5时，磷的释放量大幅下降。对系统磷去除率而言，进水最适pH为6.5，当进水pH超过7.0时，系统对磷的去除效率迅速下降，当pH值为8.0时的磷去除率仅为39.7％，系统失去了强化生物除磷能力。曝气强度对出水中CODCr浓度的影响较小，但其对出水磷浓度影响较大，当曝气强度使DO达到2.10 mg L-1时，出水磷浓度下降到0.26mg L-1的水平。污泥泥龄对系统的除磷效果影响较大，当污泥泥龄为4d时，出水磷和CODCr的浓度分别为0.25 mg L-1和25 mg L-1，MLVSS值为2.97 mg L-1，厌氧磷的释放量为33.8 mg L-1，污泥的磷含量为6.36％，EBPR系统处于良好运行状态。

论文目录:

摘要

Abstract

符号与缩略语

第一章文献综述

第一节水体富营养化和污水除磷技术概述

1. 氮、磷循环与水体富营养化

1.1 自然界中氮、磷的循环及水体中氮、磷的来源

1.2 水体富营养化及其危害

1.3 富营养化的主要控制参数

1.4 控制磷污染的主要对策

2. 我国水环境的富营养化状况

2.1 全国主要湖泊水体富营养化状况

2.2 沿海省份的赤潮发生情况及特点

2.3 全国主要河流的水质状况

2.4 全国城市生活污水的排放和处理现状

3. 污水除磷技术概述

3.1 化学除磷工艺

3.2 污水生物除磷工艺

3.3 影响污水生物除磷的参数

第二节强化生物除磷(EBPR)原理及其微生物学研究进展

1. 强化生物除磷的原理

2. EBPR系统中的聚磷菌

2.1 利用可培养的方法分离鉴定的聚磷菌

2.2 利用不依赖培养的分子生物学方法描述EBPR的群落结构组成

3. EBPR的生物化学

3.1 以乙酸作为唯一底物的代谢

3.2 以其它有机物作为底物的代谢

4. poly-P贮存物的特征和作用

5. EBPR的结构和功能的关系

5.1 利用DAPI染色来指明PAO的身份

5.2 利用FISH／染色法和FISH／MAR技术来表明PAO的身份

5.3 利用差速离心法描述聚磷菌的特性

6. 影响EBPR稳定运行的因素

6.1 进水中底物成分对EBPR的影响

6.2 聚磷菌与非聚磷菌的竞争对EBPR的影响

6.3 pH值对EBPR的影响

6.4 好氧曝气对EBPR的影响

6.5 厌氧生境对EBPR的影响

6.6 污泥龄(SRT)对EBPR的影响

7. 影响生物除磷研究进展的主要原因

第三节聚磷相关基因研究进展

1. 基因克隆的方法进展

1.1 根据已知序列克隆基因

1.2 新基因的克隆方法

2. 与poly-P合成相关的ppk和ppx基因研究进展

2.1 Pseudomonas aeruginosa 8830的ppk和ppx的克隆和表达

2.2 菌株Serratia marcescens的ppk基因的克隆

2.3 菌株Acinetobacter baumannii 252 ppk基因的表达调控

2.4 Aoinetobacter sp.ADP1 ppk基因的克隆、表达和磷酸盐饥饿诱导

2.5 EBPR活性污泥中混合菌ppk基因的克隆

3. GFP标记菌株的研究进展

3.1 概述

3.2 国内外用GFP标记微生物进行生态学研究的进展状况

第四节.选题依据及研究内容

1. 选题依据及意义

1.1 强化生物除磷研究中的问题

1.2 未来研究的方向

2. 本研究工作思路

3. 主要研究内容

第二章高效聚磷菌的筛选及生物学特性

1. 材料与方法

1.1 培养基

1.2 供试土样和污泥样品

1.3 高效聚磷菌的分离和筛选

1.4 高效聚磷菌的生理生化鉴定

1.5 高效聚磷菌的16S rDNA序列的测定

1.6 菌体生长曲线

1.7 菌体最适生长条件的研究

2. 结果与分析

2.1 高效聚磷菌株的分离和筛选

2.2 高效聚磷菌GM1和GM6的生理生化鉴定

2.3 GM1和GM6的生长曲线

2.4 培养基起始pH对GM1和GM6生长的影响

2.5 温度对GM1和GM6生长的影响

2.6 通气量对GM1和GM6的生长的影响

3. 讨论

第三章 GM1和GM6的聚磷特性

1. 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2. 结果与分析

2.1 培养基起始pH对GM1和GM6聚磷能力的影响

2.2 装液量对GM1和GM6除磷能力的影响

2.3 温度对GM1和GM6除磷能力的影响

2.4 GM1、GM6纯培养的聚磷能力

2.5 好氧培养时乙酸浓度与PHB／VSS的关系

2.6 GM1、GM6厌氧乙酸浓度与PHB贮藏及磷释放的关系

2.7 厌氧培养时乙酸吸收和磷释放的关系

3. 讨论

第四章 Pseudomonas putida GM6 ppk基因的克隆及表达

1. 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 ppk部分基因序列片段PCR扩增

1.4 SEFA-PCR扩增片段上下游序列

1.5 序列测定分析和同源性比较

1.6 ppk基因的表达

2.结果与分析

2.1 PPk部分序列片段的获得

2.2 PPk部分基因片段上下游序列片段的克隆

2.3 PPk基因序列分析

2.4 ppk基因在菌株E.coli BL21中的表达

3. 讨论

第五章高效聚磷菌GM6在活性污泥中定殖及其应用研究

1. 材料与方法

1.1 菌株与质粒

1.2 培养基与菌株生长条件

1.3 抗生素浓度

1.4 试剂和酶

1.5 污水处理试验设置

1.6 高效聚磷菌株GM6的抗性试验

1.7 gfp基因标记菌株GMTR、GMBR的构建

1.8 GMTR、GMBR荧光检测方法

1.9 含gfp质粒的遗传稳定性试验

1.10 GMTR、GMBR的生长曲线的制作

1.11 GMTR投菌试验

1.12 高效聚磷菌GM6的工程化应用

1.13 分析方法

2. 结果与分析

2.1 标记菌株的构建

2.2 GMTR强化污泥除磷效果

2.3 高效聚磷菌GM6的工程化应用结果

3. 讨论

第六章影响EBPR系统生物除磷的主要因素

1. 材料与方法

1.1 试验装置及污水组份

1.2 进水乙酸比例对EBPR系统厌氧释磷的影响

1.3 厌氧搅拌强度对EBPR系统除磷效率的影响

1.4 进水pH对EBPR系统除磷效率的影响

1.5 好氧曝气强度对系统除磷效果的影响

1.6 污泥停留时间对EBPR系统除磷效率的影响

2. 结果与分析

2.1 进水中乙酸比例对厌氧释磷的影响

2.2 厌氧段搅拌强度对厌氧释磷的影响

2.3 进水pH对EBPR系统除磷效果的影响

2.4 好氧段溶解氧浓度对除磷效率的影响

2.5 污泥泥龄对除磷系统运行效率的影响

3. 讨论

第七章全文总结及建议

1. 全文总结

1.1 聚磷菌的分离鉴定及其生物学特性

1.2 GM1和GM6的聚磷特性

1.3 GM6(Pseudomonas putida)ppk的克隆及表达

1.4 GM6(Pseudomonas putida)在活性污泥中的定殖及其应用

1.5 影响EBPR系统生物除磷的主要因素

2. 本文创新点

3. 建议

附录

附表

致谢

发表文章及专利申报情况

发布时间: 2006-10-20

参考文献

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[2].反硝化聚磷菌与传统聚磷菌富集及基质代谢特性对比研究[D]. 李亚静.天津大学2013
[3].强化生物除磷系统聚磷菌的富集反硝化除磷特性[D]. 苗志加.北京工业大学2013
[4].EBPR系统中聚磷菌与聚糖菌的竞争和调控的基础研究[D]. 由阳.哈尔滨工业大学2008
[5].外在条件对SBR生物除磷的影响及聚磷菌内在响应机制研究[D]. 韩玮.西安建筑科技大学2015
[6].多聚磷酸激酶PPK在肠外致病性大肠杆菌PCN033压力应激中的作用研究[D]. 陈静.华中农业大学2016

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