草鱼转铁蛋白和趋化因子4的克隆、鉴定及其特征分析

论文摘要

本研究对已构建的经Poly I∶C诱导的草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肝肾cDNA文库进行初步筛选、保存,并从中克隆出草鱼转铁蛋白和趋化因子基因全长cDNA序列。转铁蛋白（Transferrin,Tf）功能广泛,不仅参与机体内铁离子的运输和代谢,还在细胞呼吸、细胞生长和增殖中起重要作用,而且它具有抗菌杀菌的功能,与机体的先天性免疫有关。草鱼转铁蛋白基因（CtTf）全长cDNA 5’非编码区包含31bp,最大开放阅读框为2025bp,编码674个氨基酸,3’非编码区为266bp。CtTf编码的蛋白质N-端有1个由15个氨基酸残基组成的信号肽,第24-334和第338-665个氨基酸为2个保守的结构域,二者同源率为31%。与其它物种的转铁蛋白类似,草鱼转铁蛋白每个结构域包含4个铁离子结合位点,它们在两个结构域中的位置相对保守,除此之外,还存在多个完全保守的氨基酸残基。草鱼转铁蛋白与其它鲤科鱼类的同源性为65%-73%,与海洋鱼类同源性为43%-50%,与两栖、爬行、鸟类、哺乳类的同源性为40%-42%。系统进化树也显示草鱼转铁蛋白基因与斑马鱼和鲤鱼的亲缘关系最近。在正常草鱼肝、肠、肾、脾、心、肌肉、鳃和脑8种组织中,草鱼转铁蛋白基因在肝中的表达量最高,其次为脾和肠,在鳃和脑中有痕量表达。经Poly I∶C诱导后,肝、脾、鳃中的表达水平明显升高,其中脾脏中的表达量超过肝脏,肠和脑中几乎无变化。趋化因子（Chemokine）是细胞因子中的一个大家族,是先天性免疫系统的重要组成部分。草鱼CCL4基因全长854bp,ORF位于104-397bp,编码97个氨基酸。其中,32-73aa为其保守的CC趋化因子超家族结构域,N-端有1个由24个氨基酸组成的信号肽。草鱼CCL4与斑马鱼的同源性为69%。此外,与其他鱼类（斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus、大西洋鲑Salmo salar、虹鳟Oncorhynchusmykiss等）和哺乳类的同源性在50%以下。系统进化分析也显示其与斑马鱼CCL4基因的亲缘关系最近。适应性进化分析的结果表明:38D、43V、47A的氨基酸位点受到正选择作用。正常组织中,CCL4基因在草鱼脾脏表达量最高,心、肌、鳃、肝中次之,肠和肾中有少量表达,在脑中有痕量表达。经Poly I∶C感染后,在肝脏、脾、肠、肾、鳃中CCL4的表达水平有不同程度的增加,而心、肌、脑无显著变化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 鱼类非特异性免疫及相关因子
• 1.1 抗菌肽
• 1.2 Mx蛋白
• 1.3 alpha-2巨球蛋白
• 1.4 趋化因子
• 1.5 转铁蛋白
• 1.6 本研究的内容、目的及意义
• 第2章 cDNA文库筛选及保存
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要仪器和设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 cDNA文库的筛选
• 2.3.1.1 感受态细胞的制备和连接产物的转化
• 2.3.1.2 阳性克隆筛选
• 2.3.2 cDNA文库的保存
• 第3章 草鱼转铁蛋白和趋化因子4的克隆及特征分析
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 草鱼Tf及CCL4基因的克隆
• 3.2.2 草鱼Tf及CCL4的分子特征
• 3.2.3 转铁蛋白系统进化和同源性分析
• 3.2.4 草鱼趋化因子4的适应性进化分析
• 3.2.5 草鱼Tf及CCL4基因的组织差异表达
• 第4章 结果与分析
• 4.1 cDNA文库筛选及保存
• 4.1.1 PCR筛选文库中含有cDNA片段的克隆
• 4.2 草鱼转铁蛋白的克隆、鉴定及其组织差异表达
• 4.2.1 草鱼转铁蛋白基因的克隆
• 4.2.2 草鱼转铁蛋白分子特征分析
• 4.2.3 转铁蛋白同源性分析
• 4.2.4 转铁蛋白系统进化分析
• 4.2.5 草鱼转铁蛋白基因的组织差异表达
• 4.3 草鱼趋化因子的克隆、鉴定及其组织差异表达
• 4.3.1 草鱼趋化因子4的克隆
• 4.3.2 草鱼趋化因子4的分子特征分析
• 4.3.3 趋化因子4同源性分析
• 4.3.4 趋化因子4的适应性进化分析
• 4.3.4.1 趋化因子4系统进化分析
• 4.3.4.2 草鱼趋化因子4的正选择检验
• 4.3.5 草鱼趋化因子4基因的组织差异表达
• 第5章 讨论
• 5.1 cDNA文库的应用及筛选
• 5.2 草鱼转铁蛋白
• 5.3 草鱼趋化因子4
• 第6章 小结与展望
• 6.1 小结
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1:缩略语
• 附录2:论文发表情况