球孢白僵菌降解寄主体壁的几丁质酶和蛋白酶的分子改良

论文摘要

昆虫病原真菌具有主动侵染宿主的特点，是自然界昆虫种群数目的重要调节因素，也是防治刺吸式害虫和鞘翅目害虫的有效手段，因此具有广阔的应用前景。但是，击倒害虫时间长和防效不稳定等缺点限制了昆虫病原真菌更广泛的应用。研究表明，昆虫病原真菌菌丝穿透体壁是其侵染致病的关键步骤。在此过程中，真菌要分泌蛋白酶、几丁质酶、脂酶等多种水解酶来降解昆虫体壁，其中几丁质酶和蛋白酶具有重要作用。研究表明，在昆虫病原真菌中超量表达几丁质酶和蛋白酶基因可以提高菌株的毒力。为了进一步提高杀虫真菌的防治效果，本文采用DNA shuffling和结构域融合等技术对球孢白僵菌降解体壁的几丁质酶（Bbchit1）和蛋白酶（CDEP-1）基因进行分子改良。利用DNA shuffling技术对球孢白僵菌的几丁质酶基因Bbchit1进行定向进化，获得了几丁质酶活性提高的突变体；通过对不同来源几丁质结合域的比较，发现家蚕几丁质结合域与几丁质的结合能力最强。转基因结果表明，带有家蚕几丁质结合域的融合几丁质酶和融合蛋白酶均可以显著提高球孢白僵菌的毒力。该结果表明，几丁质结合域在提高杀虫真菌的毒力上具有重要作用。据我们所知，目前还未有利用DNA shuffling技术提高几丁质酶活性的成功例子，也未有在降解昆虫体壁水解酶上添加几丁质结合域提高昆虫病原真菌毒力的报道。主要研究结果如下： 1．Bbchit1的DNA shuffling 1．1 以大肠杆菌为展示菌DNA shuffling体系的建立 DNA shuffling中的关键技术是高效筛选体系的建立。本文选择大肠杆菌作为展示菌，根据菌落在几丁质平板上形成透明圈的大小筛选几丁质酶活性提高的突变体。因此，在大肠杆菌中表达的Bbchit1必须分泌到胞外并具有生物学活性。比较了5种不同来源的信号肽对Bbchit1分泌的影响。结果表明：1)胡萝卜欧氏杆菌果胶酶PelB信号肽引导Bbchit1分泌的能力最强；2)低温有利于Bbchit1在周质空间和胞外的累积。在18℃，胞外Bbchit1的产率是37℃的10倍。根据以上结果，选用PelB信号肽作为Bbchitl shuffling筛选体系的前导肽，并采用18℃低温筛选shuffling文库。 1．2 通过DNA shuffling获得几丁质酶活性提高的突变体经过三轮DNA shuffling，筛选了约1.5×105个克隆，最终获得两个几丁质酶活性分别提高了36％和56％的突变体shu-1和shu-2。其中，shu-1突变发生在V251E，shu-2突变发生在D71N和A281E。shu-1和shu-2的Km值低于野生型几丁质酶，

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第一部分文献综述

1.1 昆虫病原真菌在生物农药中的重要性

1.2 昆虫体壁降解酶在昆虫病原真菌侵染宿主过程中的作用

1.2.1 昆虫病原真菌的侵染过程

1.2.2 侵染过程中体壁降解酶的作用

1.2.2.1 蛋白酶

1.2.2.1.1 蛋白酶产生的调节

1.2.2.1.2 蛋白酶对昆虫病原真菌毒力的影响

1.2.2.2 几丁质酶

1.2.2.2.1 几丁质酶对昆虫病原真菌毒力的影响

1.2.2.2.2 几丁质酶的三维结构

1.3 几丁质结合域

1.3.1 几丁质结合域的三维结构

1.3.2 几丁质结合域的功能

1.3.3 几丁质结合域的缺失研究

1.4 蛋白质的定向进化

1.4.1 定点突变

1.4.2 DNA shuffling

1.4.2.1 单基因shuffling

1.4.2.2 基因家族shuffling

1.4.2.3 其它的一些shuffling方法

1.4.2.4 基于非同源序列的定向进化

1.4.2.5 DNA shuffling的应用

1.4.3 结构域融合技术

1.5 异源蛋白表达系统

1.5.1 大肠杆菌表达系统

1.5.1.1 异源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达

1.5.1.2 异源蛋白的融合表达

1.5.1.3 异源蛋白的分泌表达

1.5.2 酵母表达系统

第二部分引言

第三部分利用DNA shuffling技术提高球孢白僵菌几丁质酶Bbchit1的活性

3.1 材料

3.1.1 菌株与试剂

3.1.2 仪器

3.1.3 主要培养基和缓冲液

3.1.4 本部分使用的引物序列

3.2 方法

3.2.1 Bbchit1在大肠杆菌中的表达分析

3.2.1.1 Bbchit1原核表达载体的构建

3.2.1.2 Bbchit1的表达分析

3.2.1.3 Bbchit1的纯化及复性

3.2.1.4 Western blot

3.2.1.5 几丁质酶活性分析

3.2.1.6 GlcNAc标准曲线的制定

3.2.1.7 Bbchit1定性分析

3.2.2 不同条件对Bbchit1分泌表达的影响

3.2.2.1 不同信号肽的获得

3.2.2.2 具不同信号肽Bbchit1原核表达载体的构建

3.2.2.3 不同信号肽对Bbchit1分泌表达的影响

3.2.2.4 不同IPTG浓度对Bbchit1分泌的影响

3.2.2.5 周质空间Bbchit1的纯化

3.2.3 Bbchit1的shuffling

3.2.3.1 易错PCR

3.2.3.2 DNaseI消化及小片段的组装

3.2.3.3 组装后目的片段的扩增及筛选

3.2.3.4 大肠杆菌的电击转化

3.2.4 突变体分析

3.2.4.1 几丁质酶的纯化

3.2.4.2 突变体的酶动力学分析

3.2.4.3 最适pH和最适温度分析

3.2.4.4 突变体的二级结构分析

3.2.5 组成性表达突变基因对球孢白僵菌毒力的影响

3.2.5.1 真菌表达载体的构建

3.2.5.2 球孢白僵菌的转化及筛选

3.2.5.3 转化子的几丁质酶活性分析

3.2.5.4 转化子的PCR验证

3.2.5.5 毒力分析

3.3 结果与分析

3.3.1 Bbchit1在大肠杆菌中的表达分析

3.3.1.1 Bbchit1原核表达载体的构建

3.3.1.2 Bbchit1在大肠杆菌中的诱导表达

3.3.1.3 IPTG浓度和诱导时间对Bbchit1表达量的影响

3.3.1.4 Bbchit1的纯化、复性及生物活性分析

3.3.1.5 不同信号肽及温度对Bbchit1分泌表达的影响

3.3.1.6 IPTG浓度对Bbchit1分泌表达的影响

3.3.2 Bbchit1的DNA shuffling

3.3.2.1 DNaseI消化及组装

3.3.2.2 突变体库的筛选

3.3.2.3 突变体的序列及活性分析

3.3.2.4 酶学特性分析

3.3.2.5 突变体的二级结构分析

3.3.3 组成性表达shu-1和shu-2对球孢白僵菌毒力的影响

3.4 讨论

3.4.1 几丁质酶在大肠杆菌中的表达

3.4.2 Bbchit1的shuffling

3.5 小结

第四部分不同来源几丁质结合域的筛选、融合几丁酶的特性与重组菌株的毒力分析

4.1 材料与试剂

4.2 方法

4.2.1 Bbchit1在巴斯德毕赤酵母中的表达

4.2.1.1 Bbchit1毕赤酵母表达载体的构建

4.2.1.2 毕赤酵母的转化

4.2.1.2.1 重组表达质粒的提取

4.2.1.2.2 质粒的线性化及去磷酸化处理

4.2.1.2.3 毕赤酵母感受态细胞的制备及筛选

4.2.1.2.4 酵母转化子的G418筛选

4.2.1.2.5 酵母转化子的表型分析

4.2.1.2.6 表达分析

4.2.1.2.7 Bbchit1的纯化

4.2.2 融合几丁质酶的构建、表达及纯化

4.2.2.1 几丁质结合域的收集

4.2.2.1.1 家蚕几丁质酶几丁质结合域（BmChBD）的获得

4.2.2.1.2 云杉蚜虫几丁质酶几丁质结合域（CfChBD）的获得

4.2.2.1.3 苦瓜几丁质酶几丁质结合域（McChBD）的获得

4.2.2.1.4 环状芽孢杆菌几丁质酶几丁质结合域（BcChBD）的获得

4.2.2.1.5 果蝇围食膜结合蛋白几丁质结合域的获得（DmChBD）

4.2.2.1.6 家蚕几丁质酶几丁质结合域的突变分析

4.2.2.2 融合几丁质酶酵母表达载体的构建

4.2.2.3 融合几丁质酶在巴斯德毕赤酵母中的表达及纯化

4.2.3 融合几丁质酶的酶学特性分析

4.2.3.1 融合几丁质酶与不同底物的结合分析

4.2.3.2 融合几丁质酶的FITC标记

4.2.3.3 几丁质酶活性测定

4.2.3.4 融合几丁质酶酶动力学常数测定

4.2.3.5 融合几丁质酶的最适pH与最适温度分析

4.2.3.6 融合几丁质酶的热稳定性分析

4.2.3.7 几丁质酶对昆虫体壁的作用

4.2.3.7.1 样品处理

4.2.3.7.2 扫描电镜样品的制备

4.2.3.8 几丁质酶对几丁质寡糖的降解模式研究

4.2.3.8.1 几丁质寡糖的完整性检测

4.2.3.8.2 样品处理

4.2.4 融合几丁质酶表达载体构建及球孢白僵菌转化

4.2.4.1 融合基因的构建

4.2.4.2 单独家蚕几丁质结合域的扩增（在N端引入起始密码子）

4.2.4.3 真菌表达载体的构建

4.2.5 球孢白僵菌转化子的几丁质酶活性分析

4.2.6 转化子的PCR验证

4.2.7 转化子的Northern blot分析

4.2.7.1 真菌RNA的提取

4.2.7.2 Northern blot

4.2.8 转化子的Western blot分析

4.2.9 转化子的毒力分析

4.3 结果与分析

4.3.1 几丁质酶Bbchit1在毕赤酵母中的表达

4.3.1.1 Bbchit1酵母表达载体的构建

4.3.1.2 重组质粒转化毕赤酵母及筛选

4.3.1.3 Bbchit1的诱导表达

4.3.1.4 Bbchit1的脱盐层析

4.3.2 融合几丁质酶的构建及表达

4.3.2.1 几丁质结合域的获得

4.3.2.2 家蚕几丁质酶几丁质结合域的突变分析

4.3.2.3 融合几丁质酶的构建

4.3.2.4 融合几丁质酶在毕赤酵母中的表达与纯化

4.3.3 融合几丁质酶的酶学特性分析

4.3.3.1 融合几丁质酶与几丁质的结合分析

4.3.3.2 FITC-一几丁质酶与几丁质的结合

4.3.3.3 融合几丁质酶的热稳定性分析

4.3.3.4 融合几丁质酶的最适反应温度和pH分析

4.3.3.5 融合几丁质酶的酶动力学分析

4.3.3.6 融合几丁质酶的酶活分析

4.3.3.7 几丁质寡糖的降解产物分析

4.3.3.8 几丁质酶对昆虫体壁的降解作用

4.3.4 组成性表达融合几丁质酶基因对球孢白僵菌毒力的影响

4.3.4.1 融合几丁质酶组成性表达载体的构建

4.3.4.2 转化子的几丁质酶活性分析

4.3.4.3 转化子的分子验证

4.3.4.4 毒力测定

4.4 讨论

4.4.1 几丁质酶在酵母中表达分析

4.4.2 融合几丁质酶的酶学特性分析

4.4.2.1 融合几丁质酶与几丁质底物的结合分析

4.4.2.2 融合几丁质酶的热稳定性分析

4.4.3 融合几丁质酶对球孢白僵菌毒力的影响

4.5 小结

第五部分在类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1上添加几丁质结合域对球孢白僵菌毒力的影响

5.1 材料与试剂

5.2 方法

5.2.1 CDEP-1在毕赤酵母中的表达、纯化

5.2.1.1 CDEP-1酵母表达载体的构建

5.2.1.2 转化与筛选

+Mut⁺与His⁺Mut^-表型筛选'>5.2.1.3 His⁺Mut⁺与His⁺Mut^-表型筛选

5.2.1.4 CDEP-1的表达分析

5.2.1.5 蛋白酶活性检测

5.2.1.6 CDEP-1的纯化

5.2.1.7 CDEP-1的Western blot分析

5.2.2 融合蛋白酶的构建及其在毕赤酵母中的表达

5.2.2.1 融合蛋白酶酵母表达载体的构建

5.2.2.2 融合蛋白酶在毕赤酵母中的表达及纯化

5.2.3 融合蛋白酶的酶学特性分析

5.2.3.1 最适pH分析

5.2.3.2 融合蛋白酶与几丁质底物的结合分析

5.2.3.3 融合蛋白酶对昆虫体壁的降解及与几丁质酶的协同作用

5.2.3.4 融合蛋白酶对蚜虫体壁降解的电镜观察

5.2.4 融合蛋白酶作为添加剂对球孢白僵菌毒力的影响

5.2.5 融合蛋白酶表达载体构建及球孢白僵菌转化

5.2.5.1 载体构建及转化

5.2.5.2 转化子分析

5.3 结果

5.3.1 pPIC9K-CDEP-1载体构建

5.3.2 毕赤酵母转化子的筛选

5.3.3 CDEP-1的诱导表达

5.3.4 CDEP-1的纯化及检测

5.3.5 Western blot检测

5.3.6 融合蛋白酶基因的获得及其在毕赤酵母中的表达及纯化

5.3.7 融合蛋白酶的最适pH分析

5.3.8 蛋白酶与不溶性几丁质底物的结合分析

5.3.9 融合蛋白酶对昆虫体壁的降解及对几丁质酶活性的影响

5.3.10 融合蛋白酶对蚜虫体壁的降解

5.3.11 融合蛋白酶作为添加剂对球孢白僵菌毒力的影响

5.3.12 组成性表达融合蛋白酶对球孢白僵菌毒力的影响

5.3.12.1 融合蛋白酶组成性表达载体的构建

5.3.12.2 转化子分析

5.3.12.3 毒力分析

5.4 讨论

5.4.1 蛋白酶在毕赤酵母中的表达

5.4.2 融合蛋白酶的酶学特性分析

5.4.3 融合蛋白酶对球孢白僵菌毒力的影响

5.5 小结

第六部分结论

参考文献

附录1 文中缩写

附录2 攻读博士学位期间撰写和发表论文、专利申请情况

致谢

球孢白僵菌降解寄主体壁的几丁质酶和蛋白酶的分子改良

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