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Bcl-2和Inhibinα基因对鹅卵泡颗粒细胞增殖凋亡的影响

2020-12-01阅读(625)

Bcl-2和Inhibinα基因对鹅卵泡颗粒细胞增殖凋亡的影响

论文摘要

为研究Bcl-2和Inhibinα基因对颗粒细胞增殖凋亡的作用,构建了Bcl-2基因干扰载体（psiRNA b1、psiRNA b2、psiRNA b3）和Inhibinα基因干扰载体（psiRNA-INHα1和psiRNA-INHα2）,利用鹅F1和闭锁卵泡颗粒细胞模型研究干扰这两个基因后的表型。分别用荧光显微镜和流式细胞仪测定转染RNA干扰质粒48h后的转染效率、Bcl-2和Inhibinα基因表达水平、细胞生长周期、细胞凋亡指数（apoptosis index,AI）和增殖指数（proliferation index,PI）的变化;用放免法测定细胞培养上清中雌二醇和孕酮水平。试验结果如下:1.利用Ambion的RNA干扰设计软件,根据Genbank中已发表的序列（D11381）针对Bcl-2基因设计三对干扰序列,并根据RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体的特点在设计的序列上做了分别命名为psiRNA b1、psiRNA b2、psiRNA b3。针对Inhibinα亚基（NM-001031257）设计两对干扰序列,分别命名为psiRNA-INHα1和psiRNA-INHα2。2.采用无血清培养方法体外培养鹅卵泡颗粒细胞,将我们构建的Bcl-2和Inhibinα基因干扰载体脂质体包裹转染颗粒细胞,48h后荧光显微镜检测转染效率,干扰组转染效率达到60%以上。3.流式细胞仪检测颗粒细胞中Bcl-2蛋白表达,3个干扰组中当Bcl-2基因被干扰后颗粒细胞分泌Bcl-2蛋白明显降低,且差异显著,尤其是psiRNAb3组蛋白表达最低。4.当颗粒细胞Bcl-2表达下调时,颗粒细胞增殖指数明显上升,且随Bcl-2表达量减少而上升,增加的程度与Bcl-2表达量显著负相关（r=-0.872,p＜0.05）,颗粒细胞凋亡指数也明显上升,增加的程度与Bcl-2表达减少显著相关（r=-0.951,p＜0.05）。放免法检测Bcl-2基因干扰后颗粒细胞P分泌水平显著上升,E2分泌受到抑制。5.闭锁卵泡颗粒细胞凋亡比例显著高于F1卵泡颗粒细胞,Inhibinα基因干扰后F1和闭锁卵泡颗粒细胞抑制素表达水平比对照组降低（P＜0.05）。6.当颗粒细胞Inhibinα基因表达下调时,细胞凋亡指数和增殖指数显著高于对照组（p＜0.05）,细胞分泌雌激素水平显著下降（p＜0.05）,而细胞P分泌显著上升（p＜0.05）。结果表明,（1）Inhibinα基因干扰后卵泡颗粒细胞抑制素表达水平比对照组显著降低30～40%（p＜0.05）;细胞凋亡指数和增殖指数显著增高（p＜0.05）;细胞分泌雌激素水平显著下降（p＜0.05）。（2）Bcl-2基因干扰后颗粒细胞Bcl-2蛋白表达水平显著低于所有对照组（p＜0.05）,细胞凋亡指数、增殖指数和孕激素（P）分泌水平均高于对照组。由此推断,Bcl-2和Inhibinα基因对颗粒细胞具有显著的抗凋亡效应。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1 前言
  • 2 卵泡的发育及调控机制
  • 2.1 卵泡的生长和发育
  • 2.2 激素对卵泡发育的调节
  • 2.3 卵泡颗粒细胞的凋亡与卵泡发育
  • 2.3.1 凋亡的形态学和生物化学特征
  • 2.3.2 细胞凋亡的作用机制
  • 2.3.3 卵泡颗粒细胞的凋亡和卵泡闭锁
  • 3 Bcl-2基因及其对卵泡发育的影响
  • 3.1 Bcl-2基因及其空间结构
  • 3.2 Bcl-2基因对颗粒细胞的作用
  • 3.2.1 Bcl-2基因与细胞凋亡
  • 3.2.2 Bcl-2基因与细胞增殖
  • 3.3 Bcl-2基因的作用机制
  • 3.4 Bcl-2基因对卵泡发育的影响
  • 4 抑制素对卵泡发育的影响
  • 4.1 抑制素的结构及分泌特点
  • 4.2 抑制素对卵泡发育的影响
  • 4.2.1 抑制素对FSH分泌的影响
  • 4.2.2 抑制素对LH分泌的影响
  • 4.2.3 抑制素对卵泡的作用
  • 5 RNA干扰及其应用研究
  • 5.1 RNA干扰的发现及作用机理
  • 5.2 RNA干扰的意义及应用
  • 5.2.1 基因功能的研究
  • 5.2.2 用于信号转导通路的研究
  • 5.2.3 用于疾病的治疗
  • 5.3 RNA干扰的设计应用
  • 5.3.1 siRNA的设计
  • 5.3.2 siRNA的制备
  • 5.3.3 siRNA的转染
  • 5.3.4 RNA干扰效果的检测
  • 第二章 研究的目的和意义
  • 第三章 材料和方法
  • 1 试验材料
  • 1.1 试验动物
  • 1.2 主要药品及试剂
  • 1.3 主要仪器
  • 1.4 主要溶液的配制
  • 2 试验方法
  • 2.1 Bcl-2和抑制素α基因干扰载体的构建
  • 2.1.1 干扰载体psiRNA的获取
  • 2.1.2 siRNA的设计
  • 2.1.3 dsDNA的合成
  • 2.1.4 psiRNA与dsDNA的连接
  • 2.1.5 质粒的转化
  • 2.1.6 Bcl-2和抑制素α基因干扰载体的检测
  • 2.1.7 Bcl-2和抑制素α基因干扰载体质粒的中提
  • 2.2 颗粒细胞的分离和培养
  • 2.3 Bcl-2基因干扰对颗粒细胞增殖、凋亡和激素分泌的影响
  • 2.3.1 转染效率的检测
  • 2.3.2 Bcl-2基因干扰后颗粒细胞Bcl-2蛋白表达的检测
  • 2.3.3 Bcl-2基因干扰后颗粒细胞凋亡和增殖检测
  • 2.3.4 颗粒细胞雌二醇和孕激素的测定
  • 2.4 Inhibin α基因干扰对颗粒细胞增殖、凋亡和激素分泌的影响
  • 2.4.1 转染效率的检测
  • 2.4.2 Inhibin α基因干扰后颗粒细胞抑制素α蛋白表达的检测
  • 2.4.3 Inhibin α基因干扰后颗粒细胞增殖、凋亡的检测
  • 2.4.4 Inhibin α基因干扰后颗粒细胞雌二醇和孕激素的测定
  • 2.5 数据分析
  • 第四章 结果与分析
  • 750的双酶切鉴定'>1 psiRNA750的双酶切鉴定
  • 2 Bcl-2和Inhibin α基因干扰序列载体的酶切鉴定
  • 3 Bcl-2基因干扰对颗粒细胞增殖、凋亡和激素分泌的影响
  • 3.1 Bcl-2基因干扰后颗粒细胞Bcl-2蛋白表达的检测
  • 3.2 Bcl-2基因干扰后颗粒细胞增殖、凋亡的检测
  • 2和P影响'>3.3 Bcl-2基因干扰后对颗粒细胞分泌E2和P影响
  • 4 Inhibin α基因干扰对颗粒细胞增殖、凋亡和激素分泌的影响
  • 4.1 Inhibin α基因干扰后颗粒细胞Inhibinα蛋白表达的检测
  • 4.2 Inhibin α基因干扰后颗粒细胞增殖、凋亡的情况
  • 2和P影响'>4.3 Inhibin α基因干扰后对颗粒细胞分泌E2和P影响
  • 第五章 讨论
  • 1 Bcl-2对颗粒细胞增殖凋亡的影响
  • 2 Bcl-2对颗粒细胞分泌激素的影响
  • 3 抑制素α基因对颗粒细胞增殖凋亡的影响
  • 4 抑制素α基因对颗粒细胞分泌激素的影响
  • 第六章 小结
  • 参考文献
  • 致谢

    • 相关论文文献

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