嗜水气单胞菌拮抗细菌的筛选及其生物学特性研究

论文摘要

本研究从福州、长乐、莆田等地区的水池淤泥分离到细菌184株，以嗜水气单胞菌为指示菌，采用点接法对184株细菌进行筛选，筛选得到拮抗细菌11株：采用圆滤纸片筛选法对184株细菌进行复筛，筛选得到拮抗细菌19株。通过连续传代5代以上，丛中挑选出具有稳定遗传拮抗作用的菌株R-15进行理化试验，细菌鉴定方法鉴定拮抗菌株R-15，结果发现，R-15菌株的理化性质与沙雷氏菌属细菌极为相似，初步鉴定其为粘质沙雷氏菌。将R-15菌株与嗜水气单胞菌混合培养，结合R-15菌株培养时间与产拮抗活性物质的关系结果表明：在20h到40h之间处于拮抗作用的持续期，在20h开始产大量拮抗活性物质后，能使嗜水气单胞菌迅速受到抑制，嗜水气单胞菌菌体数量迅速减少，但是不可能完全杀死，维持在一个较低的水平。通过正交设计试验，优化了R-15菌株发酵产拮抗物的试验条件。确定了R-15菌株最佳发酵培养基组成（g／L）为：葡萄糖2％，玉米浆1％，黄豆饼粉2％，蛋白胨0.3％，硫酸铵0.5％。最佳发酵条件为：22h菌龄、4％（v／v）接种量、摇瓶装量为80ml／250ml、发酵温度为32℃、摇床转速180rpm、发酵初始pH值为7。采用最佳培养基进行液体培养，采用硫酸铵沉淀法对拮抗成分进行初步分离，结果表明，20％-70％的（NH4）2SO4不能使拮抗成分有效分离，采用正己烷、已醚、乙酸乙酯三种有机溶剂均不能把拮抗成分从发酵液中有效分离出来，说明采用萃取法获得拮抗成分粗提液的方案也不可行。采用不同浓度的乙醇处理也不能使拮抗成分有效分离，对发酵滤液进行不同温度、不同pH处理，测定其对嗜水气单胞菌的拮抗作用，结果显示R-15拮抗成分能耐受较宽的pH，在pH为3-9均保持拮抗活性，在中性和偏碱性条件下拮抗活性物稳定，当pH为9时其抑菌圈与对照几乎相当；但高温对拮抗成份活性影响较大，当温度达到60℃时，活性消失，40℃时活性最强。活性不受蛋白酶和胰蛋白酶影响。其活性组分的结构和抗菌谱还有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.2 拮抗菌在水产养殖的研究概况
• 1.2.1 乳酸菌类拮抗菌在水产养殖动物病害防治中的应用
• 1.2.2 光合细菌在水产养殖动物病害防治中的应用
• 1.2.3 免疫技术在水产养殖动物病害防治中的应用
• 1.2.4 拮抗菌制剂在水产养殖的应用
• 1.3 拮抗菌在生物防治水产病害中存在问题及展望
• 第2章 嗜水气单胞菌拮抗菌筛选
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 样品
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 实验器材
• 2.2.4 指示菌
• 2.2.5 培养基
• 2.2.6 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 细菌的分离、纯化
• 2.3.2 嗜水气单胞菌拮抗菌的筛选
• 2.3.3 形态特征与理化试验
• 第3章 拮抗菌 R-15与嗜水气单胞菌生长的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 嗜水气单胞菌生长曲线
• 3.2.2 拮抗菌株 R-15生长曲线
• 3.2.3 拮抗菌与嗜水气单胞菌混合培养生长曲线
• 3.2.4 R-15菌株代谢产物拮抗性能与培养时间关系
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 嗜水气单胞菌生长曲线
• 3.3.2 R-15菌株生长曲线
• 3.3.3 R-15菌株培养时间与产拮抗活性物质关系
• 3.3.4 混合培养实验
• 第4章 拮抗菌 R-15发酵特性研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 培养基及溶剂
• 4.2.2 发酵培养基的筛选
• 4.2.3 发酵条件的研究
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 发酵培养基的筛选
• 4.3.2 发酵条件的研究
• 4.4 讨论
• 第5章 拮抗菌 R-15发酵液活性成分特性的研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 发酵滤液的制备
• 5.2.2 拮抗成分初步分离条件的选择
• 5.2.3 拮抗成分理化性质的初步研究
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 发酵液拮抗成分的分离条件试验
• 5.3.2 发酵滤液的理化特性试验
• 5.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历