胶原纤维固化金属离子吸附材料的制备及其对蛋白质、酶和微生物的吸附特性研究

论文摘要

根据制革原理，将金属离子Fe3+、Zr4+和Al3+固定在胶原纤维上制备了新型吸附材料，并研究了这类吸附材料的物化性质。实验结果表明，胶原纤维对金属离子具有较高的固载容量，其中锆和铁的固载量分别可达563mg／g和319mg／g，且固化的金属离子耐水溶液萃取。胶原纤维与金属离子反应后，其热稳定性和等电点明显比胶原纤维高，此外，比表面积增加，吸附孔径减小。这说明，作为吸附材料使用，胶原纤维固化金属离子具有更好的性能。胶原纤维及其固化金属离子材料对蛋白质和酶的吸附实验结果表明：胶原纤维对多种蛋白质和酶具有一定的吸附作用，但其吸附容量远低于胶原纤维固化金属离子的吸附容量，说明固载的金属离子在吸附过程中起着重要作用。胶原纤维固化金属离子材料对蛋白质和酶的最佳吸附pH值随着蛋白质和酶以及金属离子的种类不同而不同。研究了胶原纤维固化铁对溶菌酶的吸附特性，包括温度、pH、初始浓度和离子强度对吸附容量的影响，以及吸附等温线、吸附动力学、固定床吸附动力学和吸附剂的解析性能。结果表明：当pH为8.0时，胶原纤维固化铁对溶菌酶的吸附容量最大，这是由于溶菌酶在固定化金属离子材料上的吸附作用主要是通过金属离子与溶菌酶分子上的组氨酸之间的螯合作用而进行的，而大多数蛋白质分子上组氨酸残基的pKa值在5.5～8.5范围内。当氯化钠浓度为0和0.25M时，胶原纤维固化铁对溶菌酶的吸附容量分别为最大和最小，这是由于金属离子亲和色谱对蛋白质的吸附在低盐浓度下主要通过蛋白质与金属离子间的螯合作用进行，在高盐浓度下主要通过疏水作用进行。吸附容量随温度和起始浓度的升高而增大，表明有化学吸附存在。当溶菌酶的起始浓度为2.5 mg／mL，吸附液体积为25mL，吸附剂用量为0.100 g时，30℃条件下胶原纤维固化铁对其的吸附量可达395 mg／g。Langmuir方程可以很好地拟合胶原纤维固化铁对溶菌酶的吸附等温线。当吸附时间为8h时，基本达到吸附平衡，吸附动力学可以用拟二级速度方程进行拟合，计算得到的平衡吸附量与实测值吻合得很好。0.25mol／L氯化钠、0.3mol／L咪唑和0.01mol／L磷酸缓冲液（pH6.0）的混合溶液对溶菌酶的解吸效果最好，其解吸率和酶活保存率分别可达96.7％和94.1％；胶原纤维固化铁吸附柱对溶菌酶具有良好的吸附柱动力学特性，能将溶菌酶大大地浓缩。吸附柱可以再生和重复使用。研究了胶原纤维固化铁对溶菌酶和白蛋白的选择性吸附。结果表明：当pH4.0时选择性吸附白蛋白，而当pH8.0时选择性吸附溶菌酶。以胶原纤维固化铁或固化锆为固定床填料，研究其从蛋清粉中分离纯化溶菌酶的效果。结果表明：这两种材料都能够一步从蛋清粉中分离纯化得到溶菌酶，HPLC检测所得溶菌酶的纯度均为100％。用于溶菌酶分离后，胶原纤维固化金属离子吸附材料易于再生。胶原纤维固化铁固定床初次和再生后用于分离纯化溶菌酶时，得率分别为70.5％和70.0％；胶原纤维固化锆固定床初次和再生后用于分离纯化溶菌酶时，得率分别为68.7％和68.4％。研究了胶原纤维固化铁对细菌的吸附特性，包括温度、pH、菌龄、初始浓度和离子强度对吸附容量的影响，以及吸附等温线和吸附动力学。结果表明：该吸附材料对细菌具有很强的吸附能力，且吸附迅速。当大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）菌体浓度分别为1.02×107cfu／mL和9.8×106cfu／mL时，10分钟后胶原纤维固化铁对它们的吸附量分别为2.23×109cfu／g和2.72×109cfu／g，90分钟基本达到吸附平衡，吸附容量分别达到2.94×109cfu／g和3.15×109cfu／g。由于其吸附速度非常快，吸附有可能是在材料的表面进行。细菌的培养时间对平衡吸附量具有显著的影响，对处于生长期的细菌吸附能力最强。吸附容量随着离子强度的增加而增加。在pH4.0～10范围内均有较强的吸附作用；温度对平衡吸附量的影响不明显；其吸附平衡符合Freundlich方程。进一步研究表明，胶原纤维固化铁对细菌的吸附动力学可以用拟二级速度方程来描述，由该方程计算得到的平衡吸附量与实测值非常吻合，误差在2％以内。研究了胶原纤维固化锆对酵母细胞（S.cerevisiae）的吸附特性和吸附规律，包括温度、pH、菌龄、初始浓度和离子强度对吸附容量的影响，以及吸附等温线和吸附动力学，并研究了固定化酵母细胞连续发酵产乙醇的效果。结果表明：当酵母的起始浓度为5.26×105cfu／mL时，吸附量可以达到8.2×107cfu／g。当pH6.0时，胶原纤维固化锆对酵母细胞的吸附量最大。酵母的培养时间对吸附量的影响很大，对处于生长期的酵母吸附能力最强。而温度对吸附量的影响不大，其吸附平衡符合Freundlich方程。当溶液中NaCl的浓度大于0.1mol／L时，酵母细胞存活率降低，吸附量减少，溶液中NaCl的浓度小于0.1mol／L时，则影响不明显。胶原纤维固化锆对酵母的吸附较为迅速，5小时基本达到吸附平衡，且吸附动力学可用二级速度方程来描述。胶原纤维固化锆吸附固定化酿酒酵母能进行连续发酵，其发酵产乙醇的能力是游离酵母发酵能力的两倍。通过测定微生物细胞表面的接触角和Zeta-电位确定其表面的疏水性及电荷，探讨胶原纤维固化金属离子材料对微生物的吸附机理。由接触角计算微生物细胞表面自由能的结果可知，S.aureus、E.coli和S.cerevisiae三者的表面均具有亲水性，且都具有很强的给电子特性。其表面疏水性大小为：S.aureus＞E.coli＞S.cerevisiae，这个顺序与胶原纤维固化金属离子对三者的吸附容量结果一致，即微生物细胞表面的疏水性越强，则胶原纤维固化金属离子材料对其的吸附容量越大。这表明，微生物与胶原纤维固化金属离子之间存在疏水作用。Zeta—电位滴定结果表明：在pH4～12范围内这三种微生物细胞表面均带负电荷。在相同条件下，三者表面所带负电荷按从多到少的顺序为：S.aureus、E.coli、S.cerevisiae，这与胶原纤维固化金属离子材料对三者吸附容量的大小顺序一致，即微生物细胞表面所带负电荷越多，胶原纤维固化金属离子材料对其的吸附容量越大。这表明，微生物和胶原纤维固化金属材料之间极可能存在静电吸附。所以，微生物在胶原纤维固化金属离子材料上的吸附是疏水和静电共同作用的结果。本研究不仅为这类吸附材料在生物分离工程、医药、环保、生物发酵工程及化学工程等领域获得广泛应用奠定了基础，同时对丰富螯合金属亲和层析（IMAC）理论也具有一定的科学意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 蛋白质的分离纯化
• 1.1.1 蛋白质分离纯化的必要性
• 1.1.2 分离纯化蛋白质的原理
• 1.1.3 蛋白质分离纯化的难点
• 1.1.4 常用的蛋白质分离纯化方法
• 1.1.5 层析法分离纯化蛋白质
• 1.1.6 固定金属离子亲和层析分离纯化蛋白质
• 1.1.7 皮胶原纤维作为IMAC基质固定化金属离子的可行性
• 1.2 水体中病原菌的清除
• 1.2.1 水体中病原微生物的种类及危害
• 1.2.2 水体中病原微生物的清除方法
• 1.2.3 胶原纤维固化金属离子吸附材料清除水体中病原微生物的可行性
• 1.3 细胞固定化技术
• 1.3.1 固定化细胞的特点
• 1.3.2 固定化微生物细胞的应用
• 1.3.3 吸附法制备固定化细胞
• 1.3.4 胶原纤维固化金属离子材料吸附固定化酵母细胞的可行性
• 1.4 固体材料吸附微生物的机理研究
• 1.5 本论文主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 胶原纤维固化金属离子吸附材料的制备及其性质研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂及仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 材料的性质
• 2.3.2 固化金属离子的固载量
• 2.3.3 金属离子的固载稳定性
• 2.3.4 材料的变性温度
• 2.3.5 材料的比表面积和空隙率
• 2.3.6 材料电荷零点的测定
• 2.3.7 胶原纤维和胶原纤维固化金属离子材料的形态特征
• 2.4 结论
• 参考文献
• 第三章 胶原纤维固化金属离子材料对蛋白质和酶的吸附研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂与仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 Lowry法测定蛋白质浓度的标准曲线
• 3.3.2 胶原纤维对蛋白质和酶的吸附比较
• 3.3.3 胶原纤维固化铁对蛋白质和酶的吸附比较
• 3.3.4 胶原纤维固化锆对蛋白质和酶的吸附比较
• 3.3.5 胶原纤维固化铝对蛋白质和酶的吸附比较
• 3.4 结论
• 参考文献
• 第四章 胶原纤维固化铁对溶菌酶的吸附
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂与仪器
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 pH对溶菌酶吸附量的影响
• 4.3.2 离子强度对胶原纤维固化铁吸附溶菌酶的影响
• 4.3.3 吸附剂用量对吸附的影响
• 4.3.4 温度对吸附平衡的影响
• 4.3.5 吸附动力学研究
• 4.3.6 静态解吸
• 4.3.7 柱吸附动力学
• 4.4 结论
• 参考文献
• 第五章 胶原纤维固化金属离子吸附材料从蛋清粉中分离纯化溶菌酶
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 试剂和仪器
• 5.2.2 实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 HPLC测定溶菌酶和白蛋白的标准曲线
• 5.3.2 胶原纤维固化铁对溶菌酶、白蛋白和蛋清粉的吸附比较
• 5.3.3 溶菌酶和白蛋白的竞争吸附
• 5.3.4 用胶原纤维固化铁从蛋清粉中吸附分离溶菌酶
• 5.3.5 用胶原纤维固化锆从蛋清粉中吸附分离溶菌酶
• 3+和Zr⁴⁺的渗漏情况'>5.3.6 分离纯化过程中Fe³⁺和Zr⁴⁺的渗漏情况
• 5.3.7 高效液相色谱法检测分离后溶菌酶的纯度
• 5.3.8 电泳法检测胶原纤维固化金属离子材料吸附分离溶菌酶的效果
• 5.4 结论
• 参考文献
• 第六章 胶原纤维固化铁（Ⅲ）对细菌的吸附
• 6.1 引言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 仪器和培养基
• 6.2.2 实验方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 滤膜法测定细菌浓度
• 6.3.2 胶原纤维及胶原纤维固化金属离子吸附材料对细菌吸附的比较
• 6.3.3 吸附平衡
• 6.3.4 菌龄对吸附平衡的影响
• 6.3.5 pH对吸附平衡的影响
• 6.3.6 离子强度对胶原纤维固化铁吸附细菌的影响
• 6.3.7 吸附动力学
• 6.4 结论
• 参考文献
• 第七章 胶原纤维固化金属离子对酵母的吸附固定化研究
• 7.1 引言
• 7.2 实验部分
• 7.2.1 试剂与仪器
• 7.2.2 实验方法
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 酵母菌悬液的紫外分光光度法标准曲线
• 7.3.2 胶原纤维和胶原纤维固化金属离子材料对酵母的吸附比较
• 7.3.3 pH对胶原纤维固化锆吸附酵母的影响
• 7.3.4 菌龄对吸附容量的影响
• 7.3.5 离子强度对胶原纤维固化锆吸附酵母的影响
• 7.3.6 温度对胶原纤维固化锆吸附酵母的影响
• 7.3.7 固化锆吸附酵母的动力学研究
• 7.3.8 固定化酵母发酵产乙醇
• 7.3.9 扫描电镜检测酿酒酵母的固定化状况
• 7.4 结论
• 参考文献
• 第八章 胶原纤维固化金属离子吸附微生物的机理研究
• 8.1 引言
• 8.2 实验部分
• 8.2.1 试剂与仪器
• 8.2.2 实验方法
• 8.3 结果与讨论
• 8.3.1 胶原纤维固化金属离子材料对微生物的吸附
• 8.3.2 微生物接触角及其表面自由能
• 8.3.3 微生物Zeta-电位的测定
• 8.3.4 胶原纤维固化铁吸附细菌后的SEM图
• 8.4 结论
• 参考文献
• 附录1 Lowry法测定的蛋白质浓度
• 附录2 Shugar法测定溶菌酶酶活
• 附录3 SDS—PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳法
• 博士期间科研成果简介
• 致谢