β-甘露聚糖酶基因整合组成型表达载体的构建及整合体的筛选

论文摘要

为实现在野生酵母菌株JSY4中组成型表达β-甘露聚糖酶,首先采用PCR方法从毕赤酵母GS115基因组DNA中扩增出500bp的三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子（PGAP）,以其取代分泌型表达载体pPIC9K的诱导型启动子（PAOX1）片断,构建了组成型载体pGAP;再从野生型酵母JSY4基因组DNA中扩增出1700bp的25S rDNA保守序列,以其取代pGAP载体上的HIS4片断,构建了整合组成型载体pGAP-rDNA;然后将重组质粒pT002-ManⅠ中的ManⅠ片断插入pGAP-rDNA的多克隆位点,获得含有目的基因ManⅠ的整合组成型表达载体pGAP-rDNA-ManⅠ。pGAP-rDNA-ManⅠ经NcoⅠ线性化后用电击法转化野生酵母菌株JSY4,通过G418抗性筛选和PCR鉴定得到阳性整合子JSY4（pGAP-rDNA-ManⅠ）,对阳性菌株培养上清液进行ELISA双抗夹心法和DNS法测定酶活,表明有β-甘露聚糖酶活性。因此,整合组成型表达载体pGAP-rDNA-ManⅠ已被构建成功,ManⅠ基因也已经整合到JSY4酵母染色体中,并进行了中组成型表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 研究背景
• 1.2 Β-甘露聚糖酶简介及国内外研究进展
• 1.2.1 Β-甘露聚糖酶简介
• 1.2.2 国内外的研究进展
• 1.2.3 Β-甘露聚糖酶的应用研究
• 1.3 酵母表达系统简介
• 1.3.1 毕赤酵母表达系统的特点
• 1.3.2 表达载体的重要元件
• 1.3.3 宿主菌株
• 1.3.4 目的基因整合到酵母基因组
• 1.4 实验的研究基础、研究目的及主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 工具酶和主要试剂
• 2.1.4 常用溶液及缓冲液
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 实验方法流程图
• 2.2.2 酵母基因组的提取
• 2.2.3 引物设计
• 2.2.4 PCR 扩增
• 2.2.5 质粒的小量提取
• 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.7 DNA 酶切
• 2.2.8 DNA 的回收
• 2.2.9 连接与转化
• 2.2.10 整合组成型表达载体PGAP-RDNA-MANⅠ的构建
• 2.2.11 重组质粒鉴定
• 2.2.12 阳性重组质粒导入野生酵母菌
• 2.2.13 G418 抗生素对野生酵母整合菌株的筛选
• 2.2.14 PCR 鉴定目的基因的整合
• 2.2.15 重组野生酵母的培养、表达及活性测定
• 3 实验结果
• 3.1 酵母基因组 DNA 的电泳结果与分析
• GAP和25S RDNA PCR 扩增结果'>3.2 P_GAP和25S RDNA PCR 扩增结果
• 3.3 PPIC9K 质粒提取的琼脂糖凝胶电泳结果与分析
• 3.4 构建的组成型载体 PGAP 的鉴定结果与分析
• 3.5 构建的整合组成型载体PGAP-RDNA 的鉴定结果与分析
• 3.6 构建的整合组成型表达载体 PGAP-RDNA-MANⅠ的鉴定结果与分析
• 3.6.1 MANⅠ的亚克隆结果与分析
• 3.6.2 整合组成型表达载体 PGAP-RDNA-MANⅠ的鉴定结果与分析
• 3.7 Β-甘露聚糖酶基因在野生型酵母菌中的组成型表达结果与分析
• 3.7.1 G418 抗生素对野生酵母整合菌株的筛选
• 3.7.2 PCR 鉴定目的基因的整合
• 3.7.3 重组酵母表达产物的测定
• 4 讨论
• 4.1 整合组成型酵母表达载体的构建策略
• 4.2 电转化酵母及外源基因表达的讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介