淀粉液化芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因的克隆与表达

论文摘要

β-1,3-1,4-葡聚糖酶能够有效地降解植物和微生物细胞壁来源的β-葡聚糖,通过添加外源β-葡聚糖酶可有效解决啤酒酿造中麦汁过滤困难,啤酒的非生物稳定性降低等问题,在饲料工业中也可提高禽畜对麦类饲料养分的吸收效率。如何获得高产β–葡聚糖酶的菌株已经成为目前研究的热点之一。本文主要以一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）为出发菌,构建了一株高效表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶的大肠杆菌（Escherichia coli）重组菌,并对重组酶的分离纯化和酶学性质进行了研究。通过PCR手段将本研究室保藏的一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌的bgl基因（GenBank数据库编号EU623974）扩增,克隆至三种不同性质的表达质粒载体pEGX-4T-1、pET20b（+）和pET28a（+）中,构建了重组质粒pEGX-4T-1-bgl、pET20b（+）-bgl和pET28a（+）-bgl。将pEGX-4T-1-bgl转化三种不同的大肠杆菌宿主;pET20b（+）-bgl和pET28a（+）-bgl分别转化E. coli BL21（DE3）,采用IPTG在30℃下诱导表达重组蛋白,比较pEGX-4T-1的GST融合表达、pET20b（+）的PelB信号肽指导的分泌型表达和常用的带有强启动子和lac操作子的pET28a（+）的组氨酸标签和T7标签的融合表达的效果。经SDS-PAGE分析和酶活测定表明,五种重组菌均表达出了重组蛋白,其中重组菌E. coli BL21（DE3）-pET28a（+）-bgl具有最高的表达酶活,总酶活可达322.0±8.8 U/mL,明显高于其他四种重组菌,为出发菌在最适摇瓶条件下所产酶活的40.1%,可以作为今后定向改造的适宜菌株。为了考察E. coli BL21（DE3）-pET28a（+）-bgl所产重组酶的实用价值,本文比较了制备粗酶液时各种破壁方法对重组酶活力的影响,结果表明冻融法效果较好。粗酶液经乙醇分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析分离纯化,经SDS-PAGE验证,得到了较纯的重组酶,纯化倍数为19.85倍,回收率为20.60 %,比活力为13,437 U/mg,分子量为30 kDa左右。对纯化后的重组酶的酶学性质研究表明,重组酶最适pH值为6.0,在pH 4.5-6.0范围内较为稳定;最适温度为50℃,40-50℃范围内较稳定,10 mmol/L的Cu2+和Fe2+对酶活有显著的抑制作用,与野生酶性质大致相同,表明该酶在啤酒酿造工业有一定的实用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 β-葡聚糖
• 1.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶国内外研究进展
• 1.2.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的来源
• 1.2.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的结构与性质
• 1.2.3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的应用
• 1.2.4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆和表达
• 1.3 大肠杆菌表达系统
• 1.3.1 概述
• 1.3.2 表达载体
• 1.3.3 宿主菌
• 1.3.4 提高外源蛋白分泌性表达的策略
• 1.4 立题意义和背景
• 1.5 主要研究内容
• 第二章 淀粉液化芽孢杆菌 β-葡聚糖酶基因克隆表达的优化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株和质粒载体
• 2.2.2 仪器设备
• 2.2.3 工具酶和试剂
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 实验方法
• 2.2.6 分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 β-葡聚糖酶基因（bgl）的扩增
• 2.3.2 表达载体pEGX-4T-1-bgl 的构建及在三种宿主菌中的表达
• 2.3.3 表达载体 pET20b（+）-bgl 的构建及在 E. coli BL21（DE3）中的表达
• 2.3.4 表达载体pET28a（+）-bgl 的构建及在E. coli BL21 （DE3）中的表达
• 2.3.5 E. coli BL21（DE3）-pET28a（+）-bgl 质粒稳定性分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 重组酶分离纯化的初步研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 仪器设备
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 试剂
• 3.2.5 实验方法
• 3.2.6 分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 重组菌破壁方法对酶活的影响
• 3.3.2 分级沉淀
• 3.3.3 离子交换层析
• 3.3.4 纯化结果分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 重组酶的酶学性质研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 酶液
• 4.2.2 仪器
• 4.2.3 试剂
• 4.2.4 酶活力测定方法
• 4.2.5 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 最适pH
• 4.3.2 pH 稳定性
• 4.3.3 最适温度
• 4.3.4 温度稳定性
• 4.3.5 金属离子对酶活的影响
• 4.4 本章小结
• 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表论文清单