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二化螟温州种群Cry1Ab抗性基因频率的F2检测及氨肽酶N基因CsAPN3的克隆

2020-12-16阅读(404)

二化螟温州种群Cry1Ab抗性基因频率的F2检测及氨肽酶N基因CsAPN3的克隆

论文摘要

二化螟Chilo suppressalis（Walker）是我国水稻上一种重要害虫,目前主要依靠化学杀虫剂进行控制。转Bt基因抗虫水稻（Bt水稻）为防治二化螟提供了一种新的有效方法,Bt水稻在几年后将在中国实现商业化种植。在Bt水稻未商业化种植之前检测二化螟田间种群对Cry1Ab的抗性等位基因频率,可以为制定预防性抗性治理策略、实施二化螟Bt早期抗性的监测和预警提供重要依据。本研究采用F2筛选法（F2 screen）检测了浙江温州地区二化螟田间种群对Cry1Ab的抗性等位基因频率,并对进行了室内抗性品系的筛选；同时对二化螟的一个氨肽酶N基因（CsAPN3）进行了克隆、序列分析和mRNA表达检测。1.F2筛选法检测二化螟温州种群对Cry1Ab的抗性等位基因频率2009年从浙江温州田间水稻上采集一代二化螟卵块,每一卵块单独饲养以建立单雌系。用Cry1Ab区分剂量对201个单雌系F2代进行了检测,发现田间种群存在对Cry1Ab的主要抗性等位基因,抗性等位基因频率估计为0.0025（95%置信区间：0.0019-0.0031）。2.二化螟对Cry1Ab抗性的室内筛选将F2检测中7个候选单雌系在区分剂量下的存活幼虫建立一个混合种群,并用Cry1Ab对其进行室内抗性筛选。连续筛选6代后,该种群对Cry1Ab的敏感性明显下降,在区分剂量下的存活率由筛选前的5%提高到35%。与苍南敏感品系相比,该筛选种群对Cry1Ab已具有10倍的抗性。3.二化螟氨肽酶N基因CsAPN3的克隆、序列分析及mRNA表达利用RTPCR和RACE技术,获得二化螟一个氨肽酶N基因的全长cDNA。根据该基因编码的氨基酸序列与其他昆虫APN的相似性,命名为CsAPN3。CsAPN3全长cDNA含有3363 bp,其开放式阅读框编码1013个氨基酸。该基因具有氨肽酶所特有的保守区域GAMEN和锌结合结构域HEXXHX18E。在CsAPN3的N-末端含有20个疏水信号序列,但C-末端没有一个具有亲脂性和跨膜特性的糖基化磷脂酰肌醇锚定点。通过实时定量PCR检测发现,二化螟CsAPN3 mRNA主要在幼虫阶段表达,幼虫中肠中CsAPN3 mRNA表达量明显高于其他组织。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1 二化螟的发生与危害
  • 2 转基因抗虫水稻
  • 2.1 转Bt基因水稻
  • 2.2 转植物或动物来源抗虫基因水稻
  • 3 苏云金芽孢杆菌
  • 3.1 苏云金芽孢杆菌概述
  • 3.2 Bt毒素的杀虫机理
  • 3.3 害虫对Bt的抗性机理
  • 4 害虫对Bt蛋白的抗性检测方法
  • 5 害虫对Bt作物抗性治理策略
  • 5.1 高剂量/庇护区
  • 5.2 多基因抗虫作物
  • 6. 本研究的内容和意义
  • 2检测'>第二章 二化螟温州田间种群对Bt毒素Cry1Ab抗性等位基因频率的F2检测
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 生物测定方法（毒素涂表法）
  • 2代法检测田间抗性等位基因频率'>2 单雌系F2代法检测田间抗性等位基因频率
  • 2代筛选法原理'>2.1 单雌系F2代筛选法原理
  • 2.2 区分剂量的确定
  • 2.3 单雌系的建立
  • 1代饲养'>2.4 F1代饲养
  • 2代饲养'>2.5 F2代饲养
  • 2筛选'>2.6 F2筛选
  • 2.7 抗性等位基因验证
  • 2.8 抗性等位基因频率值的计算方法
  • 3 抗性品系的筛选
  • 3.1 实验材料
  • 3.2 生物测定方法（毒素涂表法） （同1.2）
  • 3.3 二化螟对Cry1Ab毒素敏感毒力基线的建立
  • 3.4 抗性品系的筛选
  • 3.5 数据分析
  • 4 结果和分析
  • 4.1 区分剂量的确定
  • 2筛选'>4.2 F2筛选
  • 4.3 抗性验证
  • 4.4 抗性品系的筛选
  • 4.5 抗性等位基因频率
  • 5 讨论
  • 第三章 二化螟Bt毒素受体蛋白APN基因全长克隆、序列分析及mRNA表达量研究
  • 1 材料和方法
  • 1.1 材料和试剂
  • 1.2 主要试剂
  • 1.3 仪器设备
  • 2 二化螟APN基因的克隆
  • 2.1 总RNA的提取
  • 2.2 反转录
  • 2.3 基因克隆引物设计
  • 2.4 PCR产物的回收与纯化
  • 2.5 PCR纯化产物与质粒载体的连接
  • 2.6 转化和培养
  • 2.7 质粒DNA的提取（购于爱思进生物技术有限公司）
  • 2.8 酶切反应
  • 2.9 目标片段检测（PCR鉴定）
  • 2.10 序列分析与系统发育树的构建
  • 3 二化螟氨肽酶N基因mRNA表达量的研究
  • 3.1 RNA的提取和cDNA第一链的合成
  • 3.2 引物设计
  • 3.3 反应体系和条件
  • 3.4 实时荧光定量PCR反应效率的确定
  • 3.5 数据分析
  • 4 结果和分析
  • 4.1 二化螟氨肽酶N序列分析
  • 4.2 二化螟氨肽酶N基因相对表达量研究
  • 5 讨论
  • 全文总结
  • 参考文献
  • 致谢

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