论文摘要
背景与目的：化疗在舌癌的综合治疗中具有十分重要的作用,然而肿瘤的化疗耐受一直困扰着化疗的有效性,目前舌癌化疗耐受的机制仍远未完全阐明。microRNA（miRNA）作为转录后基因表达的调节者,不仅在肿瘤的发生发展,而且在肿瘤化疗耐受中具有重要的作用。目前尚未有miRNA介导舌癌平阳霉素（PYM）耐药的报道。本课题拟在首次筛选舌癌PYM耐药相关niRNAs的基础上,探讨以miRNA为中心的信号通路,鉴定新的预测舌癌化疗敏感性的生物学指标,为预防或逆转舌癌化疗耐药,提高化疗效果提供理论依据。方法：（1）运用miRNA芯片miRCURYTM LNA Array （v13.0）比较舌癌亲本细胞Tca8113和耐药细胞Tca8113/PYM中的差异miRNA表达谱,利用miRNA特异实时荧光定量PCR对部分差异表达的miRNA进行验证,进一步确定舌癌耐药相关的miRNA。（2）选取荧光定量PCR验证中表达差异最明显的miR-22进一步进行研究；将miR-22真核表达载体,用脂质体分别转染亲本细胞及耐药细胞,建立过表达miR-22的稳定细胞系,同时用miR-22特异性抑制剂anti-miR-22（特异性反义寡核苷酸片段）处理亲本及耐药细胞系,MTS实验检测各处理组细胞对PYM的敏感性；平板克隆形成实验检测过表达miR-22细胞组的集落形成能力。（3）通过生物信息学软件对miR-22可能调控的靶基因进行预测,结合其生物学功能和我们前期cDNA芯片结果,筛选出miR-22可能的靶基因MYST4;RT-PCR和Western blot检测miR-22表达载体和anti-miR-22转染前后MYST4的表达改变,将MYST4mRNA的3’UTR包括miR-22结合位点、上下游部分侧翼序列以及酶切位点在内的共60bp克隆入pMIR-REPORT荧光素酶报告基因载体,将其与β-gal表达质粒及miR-22表达载体共转染293T细胞,24h后检测报告基因的活性。通过反义寡核苷酸片段沉默MYST4的表达后,MTS实验检测Tca8113对PYM的敏感性。（4） Western blot检测舌癌Tca8113和Tca8113/PYM中PI3K/Akt信号通路的活性,运用P13K特异抑制剂LY294004处理Tca8113/PYM后,实时荧光定量PCR检测miR-22的表达水平,MTS实验检测LY294004处理组细胞及其对照组对PYM的敏感性。Western blot检测miR-22及MYST4表达对PI3K/Akt活性的影响。（5）实时荧光定量PCR检测PYM作用Oh,24h,36h后Tca8113中miR-22的表达,同时western blot检测相关分子的改变。结果：（1）miRNA芯片结果显示,与Tca8113比较,Tca8113/PYM中共筛选出65个差异表达的miRNA,其中上调的有41个,下调的有24个,实时荧光定量PCR验证结果显示miRNA差异表达趋势与芯片结果一致。（2）miR-22过表达能增加Tca8113对PYM的敏感性并抑制其克隆形成能力（P<0.01）,而对Tca8113/PYM则无明显影响：miR-22被抑制后两种细胞对PYM的耐受性均明显增强（P<0.01）。（3）miR-22能直接下调MYST4的mRNA及蛋白表达水平；沉默MYST4的表达能增加Tca8113对PYM的敏感性。（4）Tca8113/PYM中PI3K/Akt活性明显高于Tca8113；LY294004（PI3K特异性抑制剂）以剂量依赖性下调Akt活性及miR-22的表达,增加Tca8113/PYM对PYM的敏感性；而且,LY294004与miR-22能协同增加Tca8113/PYM对PYM的敏感性,MYST4表达沉默能下调Tca8113细胞中PI3K/Akt的活性。（5）PYM短期作用能上调miR-22的表达,而下调PI3K/Akt的活性以及MYST4的表达。结论：（1）首次构建了舌癌PYM耐药相关的miRNA表达谱。（2）miR-22直接通过降解MYST4的mRNA抑制其表达进而增加舌癌细胞对PYM的敏感性。（3） PI3K/Akt信号通路与miR-22之间存在负反馈调节,miR-22与LY294004协同增加PYM的抗癌效果。（4）miR-22,MYST4与PI3K/Akt共同参与PYM对原发舌癌的抗癌活性,原发性舌癌中可能存在PYM对miR-22的PI3K/Akt非依赖性调控,而耐药细胞中的PI3K/Akt存在niR-22/MYST4的非依赖性调控。
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