论文摘要
已有研究资料表明炎症性血管损伤是动脉粥样硬化性心血管疾病（CVD）和2型糖尿病的共同病理过程,但是炎症性血管损伤的机制至今仍不十分清楚。近年研究发现晚期糖化终产物受体（RAGE）与炎症性血管损伤有关,本研究应用反义RNA和基因芯片等技术进一步探讨RAGE在炎症性血管损伤中的作用及其机制,寻找与RAGE作用相关的基因,为防治炎症性血管损伤提供理论依据和实验基础。一、糖尿病人外周血单核细胞RAGE的表达及其与血清炎症因子的关系应用流式细胞术（FCM）检测糖尿病患者外周血单核细胞RAGE蛋白的表达,分析RAGE水平与血清炎症因子的关系。结果显示2型糖尿病患者外周血单核细胞RAGE的蛋白表达率为54.7%±8.9%,较正常对照组明显增加（ P<0.05 ）。直线相关分析显示RAGE蛋白表达率与TNF-α（r=0.43, P<0.01）和IL-6（r=0.30, P<0.05）呈正相关。多元逐步回归分析示TNF-α（P =0.025）和糖基化血红蛋白（P =0.0078）为影响RAGE蛋白表达率的显著因素。二、RAGE、PDGF-β在SD大鼠颈动脉球囊损伤后内膜中的表达建立SD大鼠颈动脉球囊损伤模型,检测RAGE、PDGF-β在颈动脉球囊损伤后内膜中的表达,并应用腺相关病毒介导的大鼠RAGE反义RNA局部处理观察RAGE在炎症性血管损伤中的作用。结果显示大鼠颈动脉球囊损伤后14 d后新生内膜组织中RAGE、PDGF-β表达明显增强（P<0.01 ）。成功构建了大鼠RAGE反义RNA腺相关病毒表达载体,并获得8.7×107个病毒颗粒/ mL的病毒原液。应用体外动脉环培养,发现在感染RAGE反义RNA腺相关病毒的颈动脉球囊损伤后内膜中RAGE的表达下降,同时PDGF-β的表达也下降（ P<0.05 ）。三、RAGE的表达水平对ECV304细胞分泌炎症因子功能的影响应用FCM和RT-PCR检测晚期糖化终产物（AGEs）对ECV304细胞RAGE表达的影响,结果显示不同浓度的AGEs作用ECV304细胞24 h,RAGE的mRNA和蛋白表达较未刺激前明显增加（P<0.05-0.01）。应用基因重组技术构建人RAGE反义RNA真核表达载体,脂质体介导转染入ECV304细胞,经抗性基因筛选阳性克隆,FCM鉴定,建立低表达RAGE的ECV304细胞克隆。结果显示转染RAGE反义RNA的细胞克隆中RAGE表达被抑制58.2%±7.1%。RAGE反义RNA减轻AGEs刺激ECV304细胞分泌TNF-α、IL-6（ P<0.05 ）。四、转染RAGE反义RNA对ECV304细胞基因表达谱的影响应用Affymetrix公司生产的人类基因表达谱芯片检测转染RAGE反义RNA对ECV304细胞基因表达谱的影响,并验证部分基因芯片结果。结果显示在RAGE高表达的细胞中表达上调达2倍的有245个基因,表达下调达2倍的有186个基因。结合生物学功能分析显示RAGE的下游基因中与炎症反应相关的基因如整合素β1（ITGB1）、基质金属蛋白酶3（MMP3）、凝血酶敏感蛋白-1（THBS1）、前列腺素G/H合成酶即环氧化酶（PTGS2）等明显上调。信号转导有关的信号分子,如磷脂酶Cβ1（ PLCβ1）、磷脂酶Cβ4（PLCβ4）、钙调素依赖性蛋白激酶IV（CAMK IV ）等基因明显上调。基因芯片结果显示多种转录因子基因表达上调及许多变化显著的未知功能基因、表达序列标签（EST）。五、磷脂酶C、钙调素依赖性蛋白激酶Ⅳ在RAGE胞内信号转导途径中的作用在基因芯片研究基础上,利用磷脂酶C（PLC）抑制剂研究PLC在AGEs-RAGE通路引起ECV304细胞胞浆游离钙浓度改变中的作用,结果显示PLC抑制剂抑制RAGE介导的细胞内游离Ca2+增加（ P<0.05 ）。构建显性负突变的CAMK IV（DN- CaMK IV）载体,利用NF-κB荧光素酶报告基因研究CaMK IV在RAGE激活NF-κB胞内信号转导途径中的作用,结果显示高表达CAMK IV增强RAGE诱导的NF-κB的活化,DN-CAMK IV部分抑制RAGE诱导的NF-κB的活化（ P<0.05 ）。本研究结果证实RAGE可能通过诱导炎症相关因子的分泌而在炎症性血管损伤中发挥重要作用,并首次发现PLC、CAMK IV是RAGE胞内信号转导途径的重要分子。
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